6个不同产地瘤背石磺肌肉脂质及脂肪酸组成分析与比较

为比较不同产地瘤背石磺(Onchidium struma)肌肉脂质和脂肪酸组成的差异性,采用气相色谱-质谱法(GC-MS)对6个不同产地(分别为江苏省盐城市亭湖区和大丰市、上海市浦东新区和崇明县、浙江省温州市苍南县、福建省厦门市)的瘤背石磺肌肉脂肪酸组成进行了分析研究。结果显示:(1)瘤背石磺肌肉磷脂/总脂(PL/TL)崇明产高达(74.84±1.38)%,显著高于其它产地的瘤背石磺(P0.05);各产地瘤背石磺肌肉中胆固醇/总脂(Cho/TL)和甘油三酯/总脂(TG/TL)含量差异不明显;苍南产瘤背石磺游离脂肪酸/总脂(FFA/TL)含量最高;(2)苍南产瘤背石磺的总饱和脂肪酸(ΣSFA)含量显著高于其它产地石磺(P0.05),总单不饱和脂肪酸(ΣMUFA)和总多不饱和脂肪酸[ΣPUFA(≥18∶2n)]显著低于其它产地石磺,其它5个产地ΣMUFA含量差异较小,各产地ΣPUFA和总高不饱和脂肪酸[ΣHUFA(≥20∶3n)]含量差异较大。浦东产瘤背石磺肌肉的C20∶5n3(EPA)、C22∶6n3(DHA)、ΣPUFA、ΣHUFA均显著高于其它产地石磺(P0.05)。研究表明,6个产地瘤背石磺肌肉中脂质及脂肪酸组成存在较大差异,上海和盐城两地的瘤背石磺含有丰富的人体必需脂肪酸,且DHA+EPA含量较高,营养价值丰富;苍南和厦门两产地的瘤背石磺具有含量较高且有特殊生理活性的脂肪酸。     

成体瘤背石磺不同组织中的重金属含量及其评价

采用原子吸收法测定了瘤背石磺栖息地(崇明北支芦苇滩涂)的水质、土壤及成体瘤背石磺不同组织中的各项重金属含量,并与相应的国家标准进行了比较。结果表明:瘤背石磺栖息地的水质和土壤基本符合相应的国家标准,仅土壤中的Cu和Zn含量略超过国家标准《土壤环境质量标准》,污染指数分别为1.39和1.09。瘤背石磺肝胰腺中积累了较多的Cu、Zn和Fe,含量分别高达314.33、258.33和192.40μg/g组织湿重,两性腺中的Zn含量为309.33μg/g组织湿重,显著高于其它组织(P<0.05),肌肉和卵黄腺中的重金属含量均较低。除Cd含量外,瘤背石磺肌肉中的其它重金属含量均符合国家标准《农产品安全质量:无公害水产品安全要求》中的规定要求,但是肌肉中Cd含量远低于CAC标准(国际食品法典委员会标准)规定的2.0μg/g湿重。     

四种石磺的脂质及脂肪酸组成分析

为比较分析紫色疣石磺、瘤背石磺、里氏拟石磺和平疣桑椹石磺4种石磺科贝类的脂质和脂肪酸组成,实验采用气相色谱/质谱法对4种石磺的脂肪酸组成进行分析研究。结果显示:1 4种石磺科贝类肌肉组织总脂(TL)主要由磷脂(PL)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(Cho)和甘油三酯(TG)组成;紫色疣石磺肌肉组织中的PL/TL高达73.12%,显著高于其他3种石磺(P0.05);瘤背石磺肌肉组织中的TG/TL达2.75%,显著高于其他3种石磺(P0.05);紫色疣石磺肌肉组织中的FFA/TL高达19.16%,显著高于其他3种石磺(P0.05);2 4种石磺肌肉组织中的脂肪酸组成较为平衡;瘤背石磺和紫色疣石磺肌肉组织中的总饱和脂肪酸(ΣSFA)含量均达35%以上;总单不饱和脂肪酸(ΣMUFA)含量从大到小的顺序依次是瘤背石磺(20.63%)、紫色疣石磺(20.49%)、里氏拟石磺(19.61%)、平疣桑椹石磺(19.42%);平疣桑椹石磺肌肉组织中的总多不饱和脂肪酸含量(ΣPUFA)达34.25%,显著高于其他3种石磺(P0.05)。4种石磺中的C20∶5n3(EPA)含量均大于C22∶6n3(DHA)的含量。研究表明,4种石磺的脂质和脂肪酸组成存在较大差异,可能与其生存环境以及生活习性的差异有关,4种石磺的肌肉组织具有较高的脂类营养价值。其中,紫色疣石磺和瘤背石磺含有丰富的人体必需脂肪酸,且营养均衡,适宜食用;里氏拟石磺具有特殊生理活性的脂肪酸成分含量较高。     

瘤背石磺肌球蛋白重链(MyHC)基因的克隆与表达分析

肌球蛋白是动物体内重要的功能性马达蛋白,调控机体的信号传导、肌肉收缩和细胞器运动,为探究肌肉在瘤背石磺(Onchidium struma)由海洋向陆地进化过程中发挥作用的分子机制,实验以石磺科4种贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)基因cDNA的全长并进行组织表达分析。研究结果显示,瘤背石磺MyHC基因cDNA全长为7566 bp,包括5895 bp的开放阅读框,228 bp的5'端非翻译区,1443 bp的3'端非翻译区,共编码1964个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质由31713个原子组成,分子式为C_(9765)H_(15897)N_(2849)O_(3150)S_(52),分子量约为225.28 kDa,理论等电点为5.56,N端信号肽具有29个氨基酸长度。瘤背石磺MyHC具有2个保守结构域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且亲水性氨基酸集中在Myosin_tail_l区。系统进化树分析显示,瘤背石磺MyHC与光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)MyHC的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MyHC基因在各个组织中均有表达,腹足和背部皮肤表达量最高,腹部皮肤、口球、肺囊中高表达,肝胰腺、蛋白腺、两性腺中微量表达(P0.05)。MyHC基因在瘤背石磺的主要运动器官腹足中高表达,说明肌肉运动对瘤背石磺湿地环境的两栖适应性具有至关重要的作用。实验结果为今后进一步研究瘤背石磺肌球蛋白重链基因进行原核表达及多克隆抗体的制备奠定了良好基础,更为深入探讨海洋无脊椎动物从海洋向陆地进化的研究提供有参考意义的分子依据。     

交配对瘤背石磺两性囊及其相关器官发育与变化的作用

采用组织学及生物化学的方法，研究了瘤背石磺（Onchidium struma）不同发育时期两性囊的组织结构及其氨基酸组成的变化。瘤背石磺的性腺发育可分为四个时期：增殖期、生长期、成熟期、休止期或耗尽期。增殖期生殖系统开始形成，生殖上皮分裂增生原始生殖细胞；生长期两性囊中生殖原细胞增殖分化迅速，囊泡内出现雌雄两类生殖细胞；成熟期两性囊囊泡中有的充满了主体（受体）的卵母细胞，有的充满了客体（授体）的前精子，有的同时分布着卵母细胞和前精子；休止期生殖系统萎缩，两性囊体积变小，囊泡内仅残留少量生殖细胞。不同发育期瘤背石磺各组织中除牛磺酸及半胱氨酸外共检出氨基酸有16种，其中均以Glu含量最高，Val含量最低，必需氨基酸中以Met含量最高，半必需氨基酸中以Arg含量最高。不同组织中氨基酸总量、必需氨基酸总量不同，但总体上看随着性腺的发育过程，各组织中氨基酸总量大体呈“高-低-高”的变化趋势，单个必需氨基酸含量与必需氨基酸总量的比值（A／E）在各不同发育阶段基本趋于一致。     

几种重要环境因子对瘤背石磺人工养殖成活率的影响

该试验通过模拟生态环境的方式系统研究了温度、盐度和相对湿度等环境因子对瘤背石磺（Onchidiumstrurna）室内养殖成活率的影响。结果显示,当养殖温度为20～26℃且昼夜温差不高于3℃,盐度控制为35左右,相对湿度调节为80％以上,养殖密度低于50只·箱-1（333只·m-3）,底泥采用海边高潮线附近的表层粉砂性盐成土,以3cm的厚度铺于养殖箱底部,光照强度低于701x时瘤背石磺死亡率最低,其成活率可达90％以上,且与其他各试验组相比均差异显著（P〈0．05）。结果表明,养殖瘤背石磺需控制温度、盐度、相对湿度、养殖密度、光照强度及底泥等各项指标;同时通过模拟生态环境、改善养殖条件等方式能够提高瘤背石磺成活率,从而实现人工条件下的长期养殖。     

瘤背石磺FMRFamide基因的克隆、分析及其在炎症刺激下的表达变化

该文研究了瘤背石磺(Onchidium reevesii)在炎症刺激后体内FMRFamide基因的表达水平变化,以及FMRFamide多肽保持其自身稳态的分子机制。以瘤背石磺转录组中FMRFamide基因片段为基础,通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到该基因cDNA的全长为2618 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为882 bp,编码293个氨基酸,系统进化树显示该基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)FMRFamide基因的亲缘关系最近,这和传统形态学分类相吻合。实时荧光定量结果显示FMRFamide基因在瘤背石磺的不同组织中均有表达,但在神经节部位的相对表达量极显著高于皮肤、腹足、肝胰腺、血细胞、性腺和肌肉组织(P<0.01)。免疫组织化学验证了FMRFamide多肽在组织中与mRNA分布的一致性。炎症刺激实验结果表明,注射脂多糖(LPS)后,实验组神经节、肝胰腺、血细胞和皮肤中FMRFamide基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),且在刺激后第12小时相对表达量达到最高。综上,瘤背石磺FMRFamide主要存在于神经节中,通过神经内分泌系统参与肌体的免疫调节,对炎症刺激下的瘤背石磺保持体内稳态具有重大作用。     

瘤背石磺肌肉生长抑制素基因的克隆及组织表达分析

为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。     

不同个体大小和环境因子对瘤背石磺水中耗氧率及皮肤特性的影响

本研究设定了3种不同规格,以及温度(15℃、20℃、25℃和30℃)、盐度(5、15、25、35和45)和pH(7.5、7.8、8.1和8.4)3种主要环境因子,通过测定瘤背石磺(Onchidium struma)耗氧率和呼吸器官组织结构的变化研究了其对瘤背石磺呼吸的影响。结果显示,个体较小的瘤背石磺的耗氧率显著高于个体较大的瘤背石磺,且温度、盐度和pH对瘤背石磺的呼吸均有显著影响(P0.05)。在低于25℃时,瘤背石磺的耗氧率和黏液腺长短径随温度的升高而增大,并在25℃时出现峰值;高于25℃后,耗氧率和黏液腺长短径随之减小;表皮厚度的变化趋势与其相反;每0.1 cm~2皮肤所含颗粒腺数目及长短径变化规律不明显。盐度组各项指标的变化规律或趋势与温度组相似,峰值出现在盐度15。pH实验组中,耗氧率和黏液腺长短径随着pH的增加而增加,表皮厚度和颗粒腺长短径却在减小,每0.1 cm~2皮肤所含颗粒腺数目先增大,在pH 8.1时达到最高值,随后急剧减少。随着时间的增加,各影响因子对瘤背石磺的呼吸强度均减小。由此得出,在水下,环境因子对瘤背石磺皮肤呼吸具有显著影响,在25℃、盐度15和pH 8.1时,呼吸代谢良好;而在15℃、盐度45和pH 7.5时,呼吸代谢受到严重胁迫,这为深入揭示瘤背石磺呼吸机制、物种保护和人工增养殖奠定基础。     

瘤背石磺两性腺周年发育规律的研究

研究了江、浙、沪地区瘤背石磺（Onchidium struma）两性腺周年发育规律。结果显示,瘤背石磺雌雄同体,雄性先熟,生物学最小型为体长2.81cm,体质量1.81g。其两性腺发育为1年1个周期,发育经历增殖期、精子发生期、精卵同步发生期、排放期和休止期。其中排放期又分精子排放、精卵排放和卵子排放,体现了精卵发生的异时性。精子的发生包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子;卵子的发生包括卵原细胞期、无卵黄期、卵黄形成期、卵黄形成后期和成熟期。成熟系数周年呈明显单峰分布,峰值出现在7～9月间;蛋白腺系数、卵黄腺系数与成熟系数具有一定的相关性,蛋白腺系数基本随着成熟系数变化而变化,卵黄腺系数随着成熟系数变化的过程中出现3个峰值,分别在6、8和12月。