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相似文献
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1.
双重PCR检测携带有t1和tdh基因的副溶血弧菌毒力菌株   总被引:5,自引:0,他引:5  
在常规PCR技术的基础上优化条件 ,建立并完善双重PCR技术 ,并通过检测阳性对照和待检样品 ,进一步确定其检测的可行性。结果表明在常规PCR方法中为阳性的样品 ,包括阳性对照以及待检样品 ,在双重PCR方法中也呈现阳性 ,为阴性的样品在本方法中则也呈现阴性 ;能在血平板中出现溶血圈的在本法中也被印证含有tdh基因。由此证实本方法确实能对tl和tdh两种基因同时进行检测 ,成功地证明了同时检测tl和tdh两种基因的双重PCR方法的可行性。该法不但具有常规PCR的优点 ,而且还能节省耗材和时间 ,可用于检测水产食品以及临床样品中的副溶血弧菌的毒力菌株  相似文献   

2.
采用PCR技术检测分离自广西钦州、北海和防城港3市凡纳滨对虾样品中的67株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)3种毒力基因tdh、trh和tlh的携带情况,并将tlh基因进行原核表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,67株副溶血弧菌均未扩增出tdh和trh基因,而tlh基因检出率为100.0%,所检副溶血弧菌的毒力基因型为tdh~-trh~-tlh~+。成功构建了原核表达质粒pET-28a-tlh,将其转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测得到大小约为53 kDa的产物,与预测值相符。经Western blotting鉴定,该重组表达产物能与抗6×His标签的单克隆抗体发生特异性反应。  相似文献   

3.
为了解对虾养殖池中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐药性和毒力基因的携带情况,2018年从山东4个地区的对虾养殖池收集分离副溶血弧菌,采用Kirby-Bauer纸片法检测其对12种抗生素的耐药性,用PCR方法检测其携带耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)的情况。从对虾养殖池共分离副溶血弧菌50株。药敏实验结果显示,副溶血弧菌对庆大霉素、硫酸新霉素和氨苄西林的耐药情况最为严重,耐药率分别高达98%、90%和86%,对氟苯尼考、氯霉素、头孢他啶等敏感性较高,耐药率分别为10%、10%和20%。88%的菌株具有多重耐药性。毒力基因检测结果显示,所有菌株均不携带tdh基因,4%的菌株表现为trh阳性。本研究表明,对虾养殖水环境中的副溶血弧菌对抗生素的耐药性较为严重,应加强副溶血弧菌的病原学监测,在养殖过程中合理使用抗生素,以实现水产养殖业健康发展。  相似文献   

4.
用57株海洋弧菌,包括26株弧菌标准菌株、20株哈维氏弧菌、11株副溶血弧菌(从不同宿主和不同地理环境中分离得到),用PCR法合成5类相应的地高辛标记的溶血素基因探针,利用其进行Southern Blot,检测这5类溶血素基因在57株弧菌中的分布。结果显示,在57海洋株弧菌中,含有TDH、HlyA、TLH、δ-VPH和HLX溶血素基因的菌株分别为2株、2株、49株、3株和30株。另外,1株霍氏格里蒙菌(Grimontia hollisae)和1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)中分别含有2个TDH溶血素基因。用鱼血平板和卵磷脂平板检测57株弧菌的溶血活性和磷脂酶活性,结果表明,弧菌溶血活性和磷脂酶活性与TLH溶血素基因具有显著相关性,与另外4类溶血素基因的关系不明显。  相似文献   

5.
洪湖碘泡虫PCR检测方法的建立与初步应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
为建立一种灵敏、特异的快速检测异育银鲫寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的方法,本研究根据洪湖碘泡虫ITS-5.8S r DNA基因序列筛选出一对特异性引物Mh F/R,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并通过特异性试验、灵敏性试验与临床检测验证其可行性。结果显示,建立的PCR检测方法能特异性扩增洪湖碘泡虫相应的基因片段,长度为479 bp,而对试验中其他9种粘孢子虫的扩增结果均为阴性;最低能检测0.1 pg的虫体基因组DNA。通过临床样品检测,PCR方法比显微镜检测的检出率提高了19.5%。结果表明,该PCR方法特异、灵敏,适用于洪湖碘泡虫的快速检测。  相似文献   

6.
为查明上海市奉贤区某对虾养殖场疑似患急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的病原菌,本研究从患病凡纳滨对虾肝胰腺组织分离纯化到1株优势菌FHBX-1,并通过人工回归感染试验确定其致病性,利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和16S rRNA、热休克蛋白HSP60基因序列分析进行综合鉴定,并检测其毒力基因。同时采用K-B纸片扩散法检测病原菌的药物敏感性并通过石蜡切片观察患病凡纳滨对虾肝胰腺组织的病理特征。结果显示:菌株FHBX-1经生理生化特征测定、16S rRNA和热休克蛋白HSP60基因序列分析,综合鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),且携带了急性肝胰腺坏死病相关的毒力基因pirAVP、pirBVP,未携带副溶血弧菌临床主要毒力基因耐热直接溶血毒素tdh和相对耐热直接溶血毒素trh基因。人工回归感染试验结果显示,凡纳滨对虾在菌液浓度为1.0×106 CFU/mL浸泡感染试验组,7 d内累计死亡率为80%,患病凡纳滨对虾具有肝胰腺颜色变白、萎缩变小,胃肠变...  相似文献   

7.
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是沿海地区常见的食源性致病菌之一,评估其在海洋环境中的存在状况对渔业生产与环境监测具有重要意义,但传统方法操作复杂或者设备繁重,往往不适合于现场快速检测。本实验采用环介导等温基因扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以tlh基因作为其标识基因,建立了海水中该菌的可视化快速检测方法。采用过滤法收集海水中的细菌,以细菌悬液为扩增模板,直接加入LAMP反应液中(免DNA提取与纯化步骤),以羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)为扩增结果指示剂,通过肉眼观察LAMP反应液颜色变化判断阴性、阳性结果。优化条件下,该方法反应约1 h可获得的最低检测限为167 CFU/m L。较之于传统PCR方法,所建立的方法分析周期短(从开始预处理样品到得出检测结果只需~2 h);灵敏度高(~10×PCR)。在验证实验中,应用该方法对青岛近岸海水中副溶血弧菌的检测,所获结果与经典培养方法和PCR方法结果一致。结果表明:该方法使用仪器简单,响应快,操作简易,可为现场快检海水中副溶血弧菌提供技术支持。  相似文献   

8.
牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用   总被引:5,自引:0,他引:5  
以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180CFU/mL.同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%.结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PcR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测.  相似文献   

9.
建立双重PCR方法检测海产品中的创伤弧菌(Vbrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)。针对创伤弧菌和副溶血弧菌的gyrB基因的不同位点设计引物,前者扩增片断的大小为968bp,后者扩增片断的大小为284bp。共对三种海产品进行了创伤弧菌和副溶血弧菌的检测,结果在部分海产品中能特异性地检测到目标菌株。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品的创伤弧菌和副溶血弧菌的检测提供了有效的方法。  相似文献   

10.
本研究对分离自发病鳗鲡的疑似创伤弧菌进行鉴定及血清型分析,经生化鉴定,从发病鳗鲡中得到7株创伤弧菌;设计了创伤弧菌溶血素基因(vlly)特异性引物,并对分离菌进行了PCR检测,创伤弧菌均可扩增出溶血素基因352 bp的目标片段,而非创伤弧菌未扩增出相应的片段;制备了创伤弧菌抗O抗原血清,凝集反应显示所得到的鳗源创伤弧菌抗O抗原血清不能与人源创伤弧菌1.1758发生凝集反应,菌株FJ03-X2抗O抗原血清可与大部分的鳗源创伤弧菌发生凝集反应。以上研究结果表明,基于溶血素基因设计的PCR引物具有良好的特异性,可用于创伤弧菌检测,鳗源创伤弧菌血清型不同于其他来源的创伤弧菌,菌株FJ03-X2的O抗原具有良好的免疫原性,可作为创伤弧菌疫苗研发的候选菌株。  相似文献   

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