锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF59的克隆、分析及其主要B细胞表位区的原核表达

从感染锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）的锦鲤（Cyprinus carpiokoi）肾脏组织中提取DNA,通过PCR扩增了KHVORF59基因。该基因全长411bp,所编码的蛋白包含136个氨基酸,分子量14.3kDa,等电点（PI）6.91,有12个潜在的O糖基化位点。此研究克隆的KHVORF59基因第130位碱基由G突变为A,使其编码的第44位氨基酸由Ala突变为Thr。采用DNAStar程序,在综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性和抗原性指数的基础上,预测了KHVORF59蛋白主要B细胞表位,并将其区段的编码序列与KHVORF59完整编码序列分别克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET32a-ORF59S和pET32a-ORF59C,转入大肠杆菌Rosetta菌株,IPTG诱导表达。SDS-PAGE及WesternBlot分析显示,pET32a-ORF59S可以高效表达,表达的截短KHVORF59蛋白主要以可溶性形式存在,采用HisBindResin填料,层析纯化了该截短蛋白。     

鲤疱疹病毒3型T分离株主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3,CyHV-3)主要免疫原性蛋白,研究采用CyHV-3-T分离株感染CCB细胞系,运用蔗糖密度梯度超速离心方法对CyHV-3进行纯化,纯化的病毒颗粒经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色后,用锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)抗CyHV-3阳性血清进行Western blotting分析和液相色谱串联质谱鉴定。结果表明,透射电镜下可观察到大量完整囊膜包裹或只有裸露核衣壳的CyHV-3颗粒,Western blotting结果显示抗CyHV-3阳性血清与多种病毒蛋白具有明显特异性免疫反应,质谱鉴定表明其中4种免疫原性蛋白分别为ORF92、ORF66、ORF72和ORF81,其中ORF66和ORF72为首次鉴定的具有免疫原性衣壳蛋白。本研究将为CyHV-3血清学诊断方法的建立、亚单位疫苗或DNA疫苗的研制提供更多候选抗原。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白,本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株(下简称CyHV-2)感染异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF),用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化,纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色后,用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示,透射电镜下观察发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒,也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示,抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应,质谱鉴定显示,其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明,通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后,本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多...     

拟态弧菌OmpU抗原表位的预测与多表位疫苗分子的设计

以拟态弧菌安徽分离株OmpU基因序列为基础,应用DNAStar Protean软件联合采用多种方法对OmpU的二级结构、柔性、亲水性、表面可能性和抗原指数等方面进行分析,预测OmpU的抗原表位,并以此设计多表位疫苗分子序列.结果表明,拟态弧菌OmpU至少含有9个B细胞表位,其中第24～31、56～66、93～111、123～129、183～198、253～258和275～287共7个区段的平均抗原指数较高.使用AAY接头以epitope5-epitope7-epitope2-epitope6-epitope3-epitope4-epitopel排列方式串联的多表位序列最接近原蛋白构象,各表位间相对独立,抗原性参数也较好,可作为研制多表位疫苗的候选分子序列.     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致鲤大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学观察,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB),盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球状,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

传染性胰腺坏死病毒VP3基因的分段表达及其抗原表位区域分析

采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒(IPNV) VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1 -VP3(L1)、pET32a-VP3( L2)、pGEX-6P1-VP3( L3)和pGE...     

鲤疱疹病毒3型ORF148 DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P0.01)。本研究旨在为CyHV-3 DNA疫苗的应用提供理论依据。     

拟态弧菌OmpU抗原表位的预测与多表位疫苗分子的设计

以拟态弧菌安徽分离株ＯｍｐＵ基因序列为基础,应用ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ软件联合采用多种方法对ＯｍｐＵ的二级结构、柔性、亲水性、表面可能性和抗原指数等方面进行分析,预测ＯｍｐＵ的抗原表位,并以此设计多表位疫苗分子序列。结果表明,拟态弧菌ＯｍｐＵ至少含有９个Ｂ细胞表位,其中第２４～３１、５６～６６、９３～１１１、１２３～１２９、 １８３～１９８、２５３～２５８和２７５～２８７共７个区段的平均抗原指数较高。使用ＡＡＹ接头以ｅｐｉｔｏｐｅ５－ｅｐｉｔｏｐｅ７－ｅｐｉｔｏｐｅ２－ｅｐｉｔｏｐｅ６－ｅｐｉｔｏｐｅ３－ｅｐｉｔｏｐｅ４－ｅｐｉｔｏｐｅ１排列方式串联的多表位序列最接近原蛋白构象,各表位间相对独立,抗原性参数也较好,可作为研制多表位疫苗的候选分子序列。     

四川地区养殖鲫鲤疱疹病毒Ⅱ型的鉴定及病理学研究

为探究疾病病因和流行特点,对患病鲫进行剖检、病理学观察、分子生物学检测及人工感染实验。结果显示,患病鲫临床表现为离群独游、浮头、全身发黑及体表出血等。剖检发现鳃、肝脏、肾脏等器官出血、肿胀和坏死,鳔点状出血。组织病理观察显示,鳃呼吸上皮细胞肿胀、坏死及脱落;肾脏局灶性坏死;脾脏组织广泛变性坏死,造血系统崩解;肝脏发生空泡变性和坏死。透射电镜观察到脾脏和肾脏中存在4种大小不同的病毒颗粒,分别为DNA病毒内核、空衣壳、实心衣壳和有包膜的成熟病毒粒子。未成熟的病毒粒子存在于细胞核,成熟的病毒粒子存在于细胞质。电镜下可见鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)在细胞核内完成核酸复制和核衣壳装配,囊膜蛋白在出核后获得。细胞核萎缩、核染色质边缘化,线粒体肿胀、坏死、嵴断裂,细胞质空泡化。取患病鲫组织匀浆滤菌后接种到鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprinid cell line,EPC)和胖头鲤肌肉细胞系(fathead minnow cell line, FHM),盲传3代后未见细胞病变。通过腹腔注射患病鲫组织匀浆进行人工感染实验,实验组鲫表现出与自然感染鲫相同的临床症状,...     

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短 ORF65 (truncated ORF65) 插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-trunORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-modORF65。重组质粒分别转入BL21 (DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,pET32a-modORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 kD。此外,利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清IgM,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的pORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。     

Establishment of a new cell line susceptible to Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV‐3) and possible latency of CyHV‐3 by temperature shift in the cells

A new cell line named CCF‐K104 predominantly consisting of fibroblastic cells showed optimal growth at temperatures from 25 °C to 30 °C. Serial morphological changes in the cells induced by Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV‐3) included cytoplasmic vacuolar formation, cell rounding and detachment. Mature virions were purified from CyHV‐3‐infected CCF‐K104 cells by sucrose gradient ultracentrifugation and had a typical herpesvirus structure on electron microscopy. Infectious CyHV‐3 was produced stably in CCF‐K104 cells over 30 viral passages. Our findings showed that CCF‐K104 is a useful cell line for isolation and productive replication of CyHV‐3. A temperature shift from 25 °C to 15 °C or 35 °C did not allow serial morphological changes as observed at 25 °C for 14 days. Under the same conditions, real‐time PCR showed that CyHV‐3 was present with low viral DNA loads, suggesting that CyHV‐3 may establish latent infection in CCF‐K104 cells. Amplification of the left and right terminal repeat sequences of the CyHV‐3 genome arranged in a head‐to‐tail manner was detected by nested PCR following an upshift in temperature from 25 °C to 35 °C. The PCR results suggested that the circular genome may represent a latent form of CyHV‐3.     

Rapid detection and differentiation of carp oedema virus and cyprinid herpes virus‐3 in koi and common carp

Carp oedema virus (CEV) and koi herpes virus (KHV) are of major concern to common carp breeders and koi enthusiasts worldwide. The viruses cause diseases that exhibit similar external signs; thus, it is difficult to distinguish between them clinically. In this study, we developed and optimized rapid and accurate single‐ and multiplex isothermal diagnostic tools, based on recombinase polymerase amplification (RPA), for detection and differentiation of CEV and KHV. The assays were combined with a lateral flow dipstick to enable visual detection of amplification products and simplify post‐amplification analysis. Both CEV‐ and KHV‐RPA assays were specific for their target virus. The lower detection limits of the assays were similar to those of established diagnostic PCR tests for the viruses. A sample preparation method was optimized to eliminate the need for total DNA extraction from fish tissues. The estimated time to perform these RPA assays, from receiving the sample to having a result, is 50 min, compared to 10 and 7 hr for CEV‐ and KHV‐PCR tests, respectively. The assays can be performed in field situations to improve screening of fish and reduce spread of these viruses and thereby enhance the common carp and koi industries.