黄鳝细胞质动力蛋白3基因的克隆及其在性逆转中的功能分析

为解析黄鳝(Monopterus albus)性逆转机制,实验以雌、雄、间性发育黄鳝为研究对象,分析不同组织、不同发育时期性腺、甲基睾丸酮处理性腺及Zebularine处理性腺原代细胞后dynlt3基因表达模式的变化及其在性腺中的表达定位。性腺转录组测序结果显示,基因全长1 082 bp,开放阅读框354 bp,编码117个氨基酸。生物信息学分析显示,dynlt3基因编码蛋白质的二级结构包含37.96%的α-螺旋,29.20%的β-折叠,32.85%的无规则卷曲。系统进化分析结果显示,黄鳝DYNLT3氨基酸序列与硬骨鱼纲中底鳉(Fundulus heteroclitus)同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明,dynlt3基因在黄鳝肌肉和脑具有较高表达,心脏次之,在其它各组织表达量较低。在性腺的不同发育时期,在间性后期和雄性中表达量显著性高于雌性与间性早期。甲基睾酮处理后黄鳝卵巢组织结构发生明显退化,卵母细胞退化且数量减少,结缔组织间出现空泡结构;dynlt3基因在卵巢中表达量显著性下调。原位杂交分析dynlt3基因在性腺组织中的表达定位结果显示,在不同性腺发育时期均检测到dynlt3...     

不同抗凝剂对黄鳝外周血抗凝效果的比较研究

为探讨黄鳝(Monopterus albus)血液适宜抗凝剂种类和最佳使用浓度,实验比较了6种常用抗凝剂对黄鳝外周血的抗凝效果及DNA质量的影响。结果显示:ACD、EDTA、肝素、草酸钾、草酸盐和柠檬酸钠的最佳抗凝终浓度分别为0.10×、0.50‰、0.016‰、0.63‰、0.025×和8.00‰,以上浓度能有效抑制凝血,且血细胞死亡率最低。最佳抗凝浓度下的短暂处理对血细胞DNA的质量无明显影响,但随着处理时间的延长,抽提获得的DNA含量均出现了不同程度的下降,含有ACD和EDTA的血液中DNA的含量下降最多,其次是草酸盐、草酸钾和柠檬酸钠,而加入了肝素的血液中DNA的稳定性最高,其含量无显著下降。     

LncRNA 54770.30在黄鳝(Monopterus albus)组织及性腺中表达特征分析

利用黄鳝(Monopterus albus)卵巢、间性性腺以及精巢转录组测序数据分析结果,筛选获得表达差异的LncRNA 54770.30。为探究黄鳝LncRNA 54770.30的生物学特性及其在性逆转过程中的功能和作用,本研究分析了黄鳝LncRNA 54770.30在不同组织与不同阶段性腺的表达。结果表明：LncRNA 54770.30在各组织均有表达,在肌肉中表达量最高,精巢与肝脏次之;LncRNA 54770.30在黄鳝卵巢至精巢转变过程中表达量呈上升趋势,卵巢与间性性腺中表达量无显著性差异,但卵巢、间性性腺与精巢中表达量呈显著性差异。利用原位杂交技术对LncRNA 54770.30在不同阶段性腺中表达进行定位分析,结果显示LncRNA 54770.30在黄鳝各阶段性腺中均有阳性信号,卵巢中主要在卵细胞的细胞质与颗粒细胞以及体细胞中表达;精巢中主要在初级精母细胞和次级精母细胞中表达。对黄鳝幼体进行甲基睾酮处理后,实验组卵巢结构出现明显退化,卵泡数量减少,出现中空小叶;荧光定量PCR分析显示,LncRNA 54770.30在实验组退化卵巢中的表达量较对照组显著下降。以上研究表明,...     

黄鳝肝脏的显微和超微结构

为了了解黄鳝(Monopterus albus)肝脏结构与功能的关系,应用光学显微镜和透射电子显微镜对黄鳝肝脏的显微和超微结构进行了观察。结果表明:黄鳝肝脏肝小叶不明显;肝细胞以中央静脉为中心呈不规则放射状分布,肝血窦交织成网状;肝细胞核大,核中位或偏位,偶见双核。肝细胞核大而圆,核仁显著,核孔明显且数目多;胞质内粗面内质网发达,呈区域化的层层排列,线粒体非常丰富且成群分布,紧密排列在核周围或与粗面内质网紧密接触;糖原颗粒丰富;可见溶酶体和脂滴。     

黄鳝生物学和增养殖技术

本文以烟威地区1994—1996年的黄鳝生物标本为主,结合已有的研究,叙述了黄鳝的形态、生态和食性等;重点论述了生殖过程中的性逆转特性;分析了该问题认识上的发展、控制机理和雄化技术的开发应用;指出不同作者所列性逆转最小全长差异的原因是地域、水温、食物组成和内分泌等诸多因素的综合反映。     

投喂频率对黄鳝幼鱼摄食、生长及饵料利用效率的影响

研究了不同投喂频率对黄鳝(Monopterus albus)摄食率、特定生长率、饵料效率、体重分化、鱼体组成的影响。试验共设5组不同投喂频率(2、3、4、12次/d和24次/d),每组3个重复,试验持续30 d。结果显示:投喂频率4次/d组的摄食率显著高于其它各组(P<0.05);特定生长率有不同程度增高,4次/d组达到最高(P<0.05);饲料利用效率4次/d组显著高于2次/d组(P<0.05),与其它组无显著性差异(P>0.05);随着投喂频率增加,各试验组组内个体体重无显著差异(P>0.05),黄鳝的规格趋于整齐。试验各组黄鳝的鱼体成分无显著性差异(P>0.05);饵料蛋白质和能量的表观消化率,在4次/d时达到最高(P<0.05)。试验表明:黄鳝的生长受投喂频率的影响,每天投喂4次是黄鳝养殖的最佳投喂频率。     

黄鳝源嗜水气单胞菌DB01分离鉴定及药敏特性研究

从患病的黄鳝(Monopterus albus)体内分离到一株致病菌株DB01,对该菌株进行人工感染、生理生化鉴定及16S r DNA序列分析。结果显示:人工感染黄鳝出现与自然发病相同的症状,表明菌株DB01为发病黄鳝的病原菌。菌株DB01为革兰氏阴性杆菌,无芽孢和荚膜,在兔血平板上能形成明显的β-溶血。序列分析显示,菌株DB01与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源性达99%。药敏试验结果显示,菌株DB01对诺氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等抗生素高度敏感,五倍子、黄柏、地榆及乌梅等中草药对菌株DB01抑菌作用强。     

抗菌肽对黄鳝生长性能及免疫力的影响

在水温27.5℃～31.2℃下,将平均体质量（30±5）g的黄鳝（Monopterus albus）饲养在长2 m×宽2 m的网箱中,分别投喂基础饲料（对照组）和添加抗菌肽200 mg/kg（组Ⅰ）、400 mg/kg（组Ⅱ）、600 mg/kg（组Ⅲ）和800mg/kg（组Ⅳ）的试验饲料。68 d后,测定黄鳝的生长及免疫相关指标及嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）攻毒后各组黄鳝的成活率和免疫保护力,研究饲料中添加抗菌肽对黄鳝生长性能及免疫力的影响。结果显示：饲料中添加抗菌肽黄鳝的相对增重率比对照组高8.9%～33.0%,饵料系数降低3.1%～16.2%,成活率高3.1%～7.2%;血清总蛋白（TP）含量显著增加（P<0.05）,酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性显著提高（P<0.05）,添加量为800 mg/kg时AKP活性最大,比对照组增加37.6%。添加量为600 mg/kg时ACP、SOD、GSH-Px和CAT活性最大,分别比对照组增加了63.3%、...     

分子标记技术在黄鳝育种中的应用

通过对几种分子标记技术的介绍,总结了分子标记技术在黄鳝(Monopterus albus)的遗传多样性分析、亲缘关系研究、性别鉴定等方面的研究应用成果。     

黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析

根据NCBI数据库报道的黄鳝芳香化酶基因的gDNA序列,设计了一对特异性引物.用Trizol试剂盒提取黄鳝脑总RNA,反转录获得cDNA第一条链,进行PCR扩增.扩增产物经过回收、连接、测序后得到了一条长1514 bp的芳香化酶基因cDNA序列.同源性比较表明该基因属于脑型P450aromB,与其他鱼类脑型P450aromB的同源性较高(>70%),与性腺型P450aromA的同源性较低(<60%),与自身性腺型芳香化酶同源性为59.5%.采用RT-PCR的方法对该基因在雄性黄鳝的各组织表达情况进行了分析,结果表明,该基因的转录本较高的表达于脑和精巢中,较低的在皮肤中表达,而在肝脏、心脏、小肠、肌肉等组织中没有检测到该基因的表达.     

黄鳝(Monopterus albus)的人繁技术及胚胎发育

采用促黄体生成素释放激类似物Ａ（ＬＨＲＨ－Ａ）给黄鳝催产，通过改进的人工湿法授精和滴水孵化，得到的平均受精率和孵化率分别是６７．５％和８９．５％，并通过活体和光学显微镜观察了黄鳝胚胎发育的时序，胚胎出膜的平均时间为１６８ｈｒ。     

黄鳝血清白蛋白的纯化及抗体制备

通过阴离子交换层析和凝胶过滤层析,从黄鳝血清中得到其血清白蛋白,命名为MAA-serum,分子量为67kDa,为单链非糖蛋白,其N末端氨基酸序列为GHKKW。用0.5mg/只MAA-serum作为免疫源免疫大白兔,经3次免疫后,抽取大白兔血液,分离血清,饱和硫酸氨沉淀,获得抗MAA-serum的多克隆抗体。经ELISA方法测定该抗体与黄鳝血清白蛋白的免疫反应,抗体滴度为1∶100000。经初步研究发现黄鳝皮肤中也有大量血清白蛋白分布,该抗体为进一步研究MAA-serum在皮肤中的分布及生物学功能打下基础。     

黄鳝ghrelin基因的克隆及分子特征分析

Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。     

Caspase-3在黄鳝性腺性逆转过程中的表达及定位分析

为探究黄鳝( Monopterus albus )Caspase-3在性腺性逆转发育过程中的功能和作用,实验扩增黄鳝 caspase-3 的部分序列,检测了其在不同发育时期性腺中mRNA表达水平、蛋白相对含量以及表达位置。通过PCR扩增获得黄鳝 caspase-3 基因cDNA序列,推导的氨基酸序列对比发现,黄鳝 caspase-3 与大黄鱼( Larimichthys crocea )和鳜( Siniperca chuatsi )亲缘关系最近。实时定量PCR ( qRT-PCR)结果显示, caspase-3 mRNA在黄鳝各发育时期性腺中均有表达,在卵黄生成期性腺中表达量最高,并伴随性腺向雄性发育表达量呈下降的趋势;而其蛋白相对含量在性腺性逆转过程中呈现逐渐上升的趋势,间性晚期最高。免疫组织化学染色结果显示,Caspase-3蛋白阳性信号定位于卵黄生成期卵母细胞细胞质、皮质小泡期卵母细胞的细胞核和颗粒细胞,以及各个发育时期性腺中初级生长期卵母细胞的细胞质和细胞核。综上,Caspase-3与黄鳝性逆转过程关系密切,推测其可能参与了性逆转过程中卵母细胞的凋亡过程。     

黄鳝质量安全风险分析

黄鳝(Monopterus albus)养殖产业近年发展较快,已在中国18个省、自治区、直辖市进行养殖,连续10年产量超过30万t.黄鳝养殖方式主要为池塘网箱养殖,其特殊的生态养殖方式对水环境污染小,影响黄鳝产品质量安全的原因主要为养殖环境及投入品.养殖环境中的重金属、农药残留等通过食物链及其他途径影响黄鳝产品质量.在...     

不同来源黄鳝(Monopterus albus)繁殖力的比较分析

比较不同来源黄鳝(Monopterus albus)的个体繁殖力,研究了其个体繁殖力分布特征、变化规律及与生物学指标的关系.以怀卵量作为绝对繁殖力的表征参数,对雌性黄鳝进行解剖测定.结果显示,野生黄鳝绝对繁殖力(F)为181-729粒,人工培养黄鳝F值为165-589粒,人工繁育黄鳝F值为135-352粒;野生黄鳝基于体重的相对繁殖力(FW)为5.4-11.8粒/g,人工培养黄鳝FW为3.5-9.3粒/g,人工繁育黄鳝FW为4.96-8.55粒/g;野生黄鳝基于体长的相对繁殖力(FL)为5.8-17.2粒/mm,人工培养黄鳝FL为4.85-15.00粒/mm,人工繁育黄鳝FL为4.35-9.03粒/mm,不同来源黄鳝在F、FL、FW上均有极显著差异(P＜0.01).来源和体色均不同的黄鳝其F和FL均具有极显著差异,而FW差异不显著;所有黄鳝的F和野生黄鳝的FL与体长、体重生物学指标密切相关,其余F、FL和FW与各生物学指标均相关性较小.研究表明,野生黄鳝的F、FL和FW均高于人工培养和人工繁育的黄鳝,怀卵量优势明显.     

黄鳝内脏铁型超氧化物歧化酶的纯化

经丙酮分级沉淀,DEAE-琼脂糖离子交换层析和Sephacry1S-200凝胶过滤,从黄鳝内脏中分离纯化获得铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD),并对其部分性质进行分析鉴定。获得该酶的比活力为1500U mg,提纯倍数为368 5,回收率为24 7%。该酶最大紫外吸收波长为280nm。聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电点聚焦电泳结果表明纯化酶蛋白呈一条带,测得该酶分子量约为87kD,亚基分子量约为14 5kD;等电点为pH7 1。     

黄鳝肠道蛋白酶的分离纯化及其性质

黄鳝(MonopterusalbusZuiew)肠道经组织捣碎,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose离子交换层析和SephacrylS 200凝胶过滤,得到蛋白酶纯品。经等电聚焦电泳和SDS PAGE均显示为单一条带。酶的等电点为6 2,最适温度为55℃,最适pH值为10 5,Km(酪蛋白)值为5 5×103mg/L。用SDS PAGE和SephacrylS 200测得其分子量分别为26kD和25 5kD。酶的pH稳定性较好,在pH12时室温保持5h,活力还剩55%。NBS、BrAc、TNBS、PMSF对酶有很强的抑制作用,而PCMB、ME对酶活性影响不大。Ca2+对酶活性无激活作用,Mg2+和K+对酶活性有轻微抑制作用,EDTA对酶活性有很强的抑制作用,Na+对酶活性无影响。