池塘养殖刺参病原菌塔式弧菌的分离与鉴定

2013年春季,福建漳州地区池塘养殖刺参(Apostichopus japonicus)感染不明病原而患病。病参表现出排脏、身体萎缩、体表溃烂等症状,俗称为"腐皮综合征"。为确定引起该病的病原菌,从患病刺参病灶部位分离得到1株优势菌FJY001,经回接感染试验,证实所分离的细菌为刺参的病原菌。经形态、生理生化、16S rRNA序列分析和Biolog微生物自动鉴定系统等多项指标鉴定,确定该病原菌为塔式弧菌(Vibrio tubiashii)。     

灿烂弧菌对刺参养殖的危害及防控方法

<正>刺参(Apostichopus japonicus)是我国北方重要的水产养殖经济种类。刺参受病原菌侵害后会出现腐皮综合征、烂胃症、口围肿胀症等疾病。仅2003-2005年,由于刺参腐皮综合征而导致的经济损失就达20亿元。2016年年初,福建宁德霞浦海参在养殖过程中也频繁出现腐皮综合     

刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病.发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重.以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序.根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针.该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V. Fluvialis,V. Anguillarum,V. Alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V. Harveyi,V. Parahaemolyticus,V. Vulnificus均呈阴性.探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg, 具有较高敏感度.用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%.结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌.用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑.     

刺参腐皮综合征防治措施

<正>21世纪以来，刺参养殖在我国蓬勃发展，现已成为我国北方沿海地区的重要经济养殖品种之一。但随着刺参养殖业的快速发展，各种病害频繁发生^[1]。刺参养殖主要的病害有腐皮综合征、化板症、烂胃病、盾纤毛虫病等，其中腐皮综合征发生频率较高，危害较大。腐皮综合征又称“溃烂病”“烂皮病”“化皮病”，多发生在1—4月，其中2—3月为发病高峰。幼参到成参均可发病，幼参发病率更高，     

养殖刺参保苗期重大疾病“腐皮综合征”病原及其感染源分析

2003～2005年冬、春季,山东省和辽宁省众多养殖区域的保苗期刺参(Apostichopus japonicus)暴发了较为严重的传染性疾病-"腐皮综合征".该病波及面广,传染性强,死亡率常高达90%以上.发病症状主要表现为厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡.本研究对症状较为典型的3家海参保苗期的发病幼参进行了详细的病原学分析,从所有病参的病灶组织分离得到了1种占有绝对优势的菌株,经人工感染实验证明它对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同.通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致保苗期刺参"腐皮综合征"的致病菌是假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens).同时也对3家养殖场刺参保苗养殖系统进行了分析研究.结果表明,水源中细菌含量不高,为(0.8×102)～(1.2×102)cells/mL,其特征与病灶处优势菌不同;而饵料中细菌含量最高可达3.2×106 cells/mL.饵料、池水和池底污物的优势菌与病灶处优势菌基本一致,说明饵料可能是病原菌的主要来源.本研究首次揭示了"腐皮综合征"导致保苗期刺参大规模死亡的原因及其致病原,对刺参健康养殖和病害防治具有重要的指导意义.     

养殖刺参腐皮综合征病原菌的分离与鉴定

2003年春季，山东省青岛地区刺参养殖场暴发了较为严重的传染性疾病一“腐皮综合征”，该病引起的死亡造成约30％的损失。养殖刺参的发病症状表现为：厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。从患病个体溃疡部位分离得到一种优势细菌KL-1，KL-1经人工回接感染实验证明对健康刺参具有较强的致病性，且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明，导致养成刺参“腐皮综合征”的致病菌是灿烂弧菌（Vibrio splendidus）。本文首次揭示了该地区“腐皮综合征”导致养成刺参大规模死亡的致病原因，对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病，导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板，PCR扩增出16s-23s间隔区序列，将该片段克隆进pMD19-T Vector，转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物，合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性，而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性；探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测，其检出率均为100%。研究结果表明，该探针具有良好的特异性和敏感性，可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次，它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

低温期养殖刺参腐皮综合征的发生与环境因子间的关系

为研究低温期养殖刺参腐皮综合征的发生与环境因子之间的关系,2006年1-5月在青岛周边地区3个养殖场刺参腐皮综合征发生的早期,采用异养菌总数TSB平板计数法、弧菌TCBS平板计数法对发病池塘的水质和池塘中异养菌总数和弧菌总数的数量与分布以及刺参肠道中的异养菌总数和弧菌总数进行了研究,同时比较研究了刺参病灶组织中优势菌与池塘环境及刺参肠道中优势菌的相关性.结果表明:发病池塘水体中细菌的数量较少,但底层水体中细菌总数普遍多于表层,水体中的优势菌与刺参病灶组织中的优势菌相关性不大;池塘表层底泥和刺参肠道中异养菌总数较多,弧菌总数较少,其优势菌与刺参病灶组织优势菌具有一致性.刺参腐皮综合征的发生与池塘水体分层引起的水质恶化和底泥中异养菌的数量密切相关.     

养殖刺参“腐皮综合征”致病菌——灿烂弧菌的原位杂交检测方法的建立与应用

以养殖刺参“腐皮综合征”的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S~23S间隔区序列，设计特异性引物，用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针，建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法，并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示，感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性，而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中，阳性信号（显色）强弱清晰，能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度，这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础，也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。     

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原——灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失.根据其主要致病原灿烂弧菌(VibrioQQQsplendidus)的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究.结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.Fluvialis、V.Anguillarum、V.Alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.Harveyi、V.Parahaemolyticus、V.Vulnificus的DNA均无交叉反应.应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%.研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌.在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法.     

两种弧菌对菲律宾蛤仔代谢途径影响的比较研究

采用基于核磁共振波谱技术的代谢组学技术,探索菲律宾蛤仔在受到鳗弧菌和灿烂弧菌感染的代谢物变化特征,构建菲律宾蛤仔对弧菌感染后的代谢网络调控图谱,并比较两种弧菌毒性效应的差异。试验结果表明,3种代谢物葡萄糖、谷氨酸、苏氨酸在两种弧菌感染时均发生了变化,表征鳗弧菌感染的代谢物为牛磺酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸;而表征灿烂弧菌污染的代谢物为甜菜碱、二甲基甘氨酸、胆碱、谷氨酸、亚牛磺酸。     

中草药对刺参腐皮综合征病原菌的体外抑菌试验

用改良二倍稀释法和抑菌圈法测定了24种单方中草药和9种复方中草药对刺参腐皮综合征4种重要病原菌灿烂弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌和恶臭假单胞菌的体外抑菌活性。结果显示,不同中草药对特定病原菌抑菌效果差异较大,单方中草药最低抑菌浓度（MIC）为1.56mg/ml,中草药水煎剂H-5和H-9对假交替单胞菌的抑菌圈最大,达22mm。单方中草药中穿心莲、大青叶、金银花和川芎4种中草药对4株病原菌抑菌效果最好,其水煎剂对4株病原菌平均抑菌浓度分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/ml;平均抑菌圈直径分别是17.5、11.3、14.0和11.5mm。将筛选的4种单方中草药组成9种复方,复方MIC和抑菌圈均显著好于单方,最低MIC降低到0.20mg/ml。其中复方HC-G和HC-D抑菌浓度最低,效果最好,平均抑菌浓度分别降低为0.54和0.64mg/ml;平均抑菌圈直径分别为15.3mm和16.3mm。试验结果显示,复方最佳配比为穿心莲、大青叶、金银花和川芎=2∶1∶3∶2。该复方可为生产高效专用中草药,以替代抗生素,为刺参健康养殖提供技术保障。     

Two pathogens of Greenshell™ mussel larvae, Perna canaliculus: Vibrio splendidus and a V. coralliilyticus/neptunius-like isolate

Bacterial pathogens of Greenshell™ mussel (GSM) larvae can cause batch losses during hatchery production. Twenty-two isolates were screened using a larval bioassay. Two strains were identified as potential pathogens. Phenotypic identification of these strains revealed two non-reactive Gram-negative, oxidase positive rods. Sequencing of the 16S rRNA gene identified Vibrio splendidus and a V. coralliilyticus/neptunius -like isolate as pathogens of GSM larvae, with an ability to cause 83% and 75% larval mortality in vitro , respectively, at a concentration of 10² CFU mL⁻¹. Histopathology indicated that the route of infection was via the digestive system. Using healthy larvae as target hosts, Koch's postulates were confirmed for the two isolates. This is the first report on pathogens of GSM larvae.     

麻保沙星对主要海洋致病性弧菌的体外抗菌活性及抗菌后效应

采用牛津杯法和试管二倍稀释法分别测定麻保沙星对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、费氏弧菌(V.fischeri)及灿烂弧菌(V.splendidus)的敏感性、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并与盐酸二氟沙星、盐酸恩诺沙星、诺氟沙星及氟苯尼考进行比较;采用菌落计数法测定麻保沙星对溶藻弧菌、哈维氏弧菌和灿烂弧菌的抗菌后效应(PAE)。结果表明,麻保沙星对4种弧菌的体外抗菌活性与氟苯尼考相近,高于盐酸二氟沙星、盐酸恩诺沙星和诺氟沙星;麻保沙星在1×MIC、2×MIC和4×MIC浓度时,对溶藻弧菌、哈维氏弧菌和灿烂弧菌的PAE值分别为:0.49h、0.87h和1.17h;0.64h、0.98h和1.22h;0.75h、1.02h和1.25h,表明麻保沙星对溶藻弧菌、哈维氏弧菌和灿烂弧菌均有不同程度的抗菌后效应,且PAE值与药物浓度呈正相关。     

仿刺参幼体烂胃病及其致病原鉴定

山东、辽宁两省在仿刺参（Apostichopus japonicus）苗种培育期间的5-7月，耳状幼体易发生一种以胃壁增厚、萎缩、溃烂为主要特征的“烂胃病”。从患烂胃病的耳状幼体中分离到1株细菌LW-1，人工回接感染实验证实其具有较强的致病性，并与自然发病症状相同。通过API半自动化鉴定和常规的生理生化试验的结果表明，LW-1具有弧菌属的特征，其表型特征与灿烂弧菌（Vibrio splendidus）相似。对该菌株16S rRNA基因序列分析和构建系统发生树。结果显示，菌株LW-1与灿烂弧菌的亲缘关系最近，相似率达到99．8％。菌株LW-1可鉴定为灿烂弧菌，并视为耳状幼体烂胃病的致病原之一。通过对多起仿刺参苗期烂胃病的调查研究表明，烂胃病病原也具有多样性和复杂性，并与投喂老化腐败的单胞藻饵料有关。     

鲆鲽类循环水养殖系统中病原菌的分布及杀除工艺

以半滑舌鳎皮肤溃疡病的致病菌灿烂弧菌Vibrio splendidus和哈维氏弧菌Vibrio harveyi为指示菌，研究了循环水养殖系统各环节中细菌分布和消除工艺。结果表明，不健康的苗种携带病原菌进入养殖系统后，可分布在残饵、池壁污物、养殖工具及循环水各处理环节。而弧形筛过滤、曝气池气升、紫外线消毒是循环水养殖系统消除细菌的三大环节。用5×10-6 mol/L的KMnO4溶液浸泡工具2h，对细菌的杀灭率达到100%；用25×10-6 mol/L的KMnO4溶液擦拭养殖池壁污物1.5min后，细菌杀灭率高于90%；用100×10-6 mol/L浓度的H2O2溶液对养殖舌鳎病鱼进行药浴消毒处理10min，对体表细菌的杀灭率达到了94.49%。对鲆鲽鱼类循环水养殖系统中细菌的分布和消除效果进行了系统研究，研究结果可为建立循环水健康养殖工艺提供理论数据和参考。     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

氟苯尼考对3种海洋致病性弧菌的体外抗菌后效应

采用菌落计数法分别测定氟苯尼考对溶藻弧菌、哈维氏弧菌和灿烂弧菌的抗菌后效应（PAE）。结果表明，药物的浓度越大，对细菌生长繁殖的抑制作用就越强；除去药物后，细菌的生长恢复速度就越慢。其中，细菌的生长恢复速度和强度依次为溶藻弧菌〉哈维氏弧菌〉灿烂弧菌。在1×MIC、2×MIC和4×MIC浓度时，氟苯尼考对溶藻弧茵、哈维氏弧菌和灿烂弧茵的PAE值分别为0．39、0．46和1．07h，0．48、0．70和1．12h，0．63、1．03和1．19h，表明氟苯尼考对溶藻弧菌、哈维氏弧菌和灿烂弧茵均有不同程度的PAE，且PAE值与药物浓度呈正相关。因此在制定给药方案时，可以参考本研究结果适当地延长给药时间间隔，减少给药次数，仍能维持较好的抗菌效果。