环境因子对链状亚历山大藻生长的影响

链状亚历山大藻是一种能产生麻痹性贝毒的有害赤潮藻类,研究环境因子对链状亚历山大藻生长特性的综合影响,找到链状亚历山大藻生长的适宜条件,对有效预报赤潮形成具有十分重要的意义.本文设计了四因素三水平的正交实验,研究了温度、盐度、营养盐、光照强度等环境因子对链状亚历山大藻生长特性的影响.结果表明,在实验范围内,链状亚历山大藻...     

抑制消减杂交（SSH）及其在鱼类基因克隆中的应用

和其它脊椎动物一样,在鱼类的生命进程中,某种特定类型的细胞中只有比例约为10%～15%的基因表达.由于这些基因的特异性决定了从受精卵到机体死亡的整个生命过程,所以这些基因的时空表达是受到严格调控的.在不同发育阶段,不同生理状态和不同类型的细胞中,表达的基因各不相同.因此,比较两种不同类型细胞中基因表达的差异,可以探究表型的遗传原因,了解生命过程的基本信息,从而找到与发育、疾病等相关的基因.     

链状亚历山大藻的培养及麻痹性贝类毒素的提取和检测

为了研究麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning toxins,PSP)的来源和检测,对实验室分离培养的产麻痹性贝类毒素的链状亚历山大藻进行了研究。首先通过接种对数生长期藻细胞,培养8 d内就能达到最高细胞密度(2.4×10⁴ cells/mL)左右,再以0.05 mol/L的醋酸超声波破碎藻细胞提取粗毒素,结合小白鼠生物检测法,经高效液相色谱分析,本株藻主要含有C1/2、GTX4、GTX5和NEO,浓度分别为GTX5(0.827 5)>GTX4(0.339 2)>C2(0.252 6)>NEO(0.126 6)>C1(0.045 5)(单位:μmol/L),毒素粗提液经过Sephadex-G15凝胶层析柱处理,用小白鼠生物法和荧光分光光度法联合检测定位,收集到纯度较高的PSP,本论文工作为将来贝类毒素的研究提供资料。     

链状亚历山大藻暴露下紫贻贝体内麻痹性贝毒蓄积转化规律

本研究将紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)暴露于一株麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)优势产毒藻——链状亚历山大藻(Alexandrium catenella, GY-H25株),模拟现场赤潮藻密度,探究了紫贻贝内脏团和可食组织中蓄积代谢及生物转化过程,并通过蓄积代谢动力学,重点比较了不同细胞密度GY-H25对紫贻贝体内毒素蓄积代谢和转化情况的影响。结果显示,GY-H25生长及产毒稳定,PSTs组分主要为N-磺酰胺甲酰基类毒素(C1和C2),单细胞最高产毒能力为2.96 pg STXeq/cell。暴露实验中,紫贻贝对PSTs有较强的蓄积作用,2种暴露浓度下PSTs含量变化趋势一致,实验结束时,2种暴露组紫贻贝内脏团中PSTs均超过欧盟国际限量标准(800 μg STXeq/kg),但可食组织则均低于限量标准;比较发现,高浓度组紫贻贝内脏团最高蓄积浓度达到6 815.36 μg STXeq/kg,且高浓度组暴露期间平均蓄积速率为17.89%,显著高于低浓度组13.06%的蓄积速率。另外,紫贻贝对PSTs表现出较强的生物转化能力,在对C1、C2和GTX5三者的转化研究中发现,快速代谢时期和平稳期C2→GTX5的转化为GTX5生成的主要途径,同时期C1的相关转化中C1→GTX5途径超过C2→C1,致使C1整体占比减少。综合评估紫贻贝中PSTs转化产物和毒性当量因子(toxic equivalency factor, TEF),发现紫贻贝对PSTs代谢转化进一步促使高毒性GTX5的生成和占比提升,总体终端毒性升高,这也可能是秦皇岛紫贻贝中PSTs风险严峻的主要原因之一。因此,本研究有助于科学评估紫贻贝中PSTs风险,为建立区域性风险监测技术提供科学基础。     

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。     

海带雄配子体抑制消减cDNA文库的生物信息学分析

对海带(Landnaria japonica Axesch.)雄配子体抑制消减cDNA文库进行生物信息学分析,并通过Northern印迹杂交进一步验证了雄配子体2个优先表达的基因.结果表明,(1)由627个克隆产生的618条高质量cDNA可聚类成187条非冗余序列(NRS);其中93条Contig由524条cDNA拼接而成,剩下的94条为Singleton(只有单条cDNA),冗余率达69.74%.(2)5条NRS因与rRNA基因相匹配而不进行分析;60条NRS与GenBank中注释蛋白基因显著匹配;122条NRS无显著匹配.(3)大部分已知功能的基因与物质和能量代谢(26.7%)、生长发育(13.3%)有关,其中与叶绿体光捕获蛋白复合体有关的基因有106条cDNA,所涉及的有lhcf6基因(62条cDNA)与fcp基因(12条cDNA)等.(4)经Northern印迹杂交证实lhcf6和fcp2个基因在处于营养生长期的雄配子体中优先表达.(5)90条Contig的总G+C含量平均值为52.58%,表明了密码子的使用对G、C有明显的倾向性;20个推测功能蛋白(1520密码子)密码子第三位碱基的使用偏好C(40.7%),其次是G(33.9%);终止密码子的使用偏好TGA(54.5%).本研究为海带雌、雄配子体差异表达基因克隆、分析和功能基因组学等研究提供了信息.     

不同处理的红茶与绿茶对塔玛亚历山大藻的抑制作用

有毒赤潮暴发会威胁海洋生态系统平衡,寻找抑藻材料对控制赤潮具有重要意义.以有毒赤潮藻塔玛亚历山大藻为研究对象,研究红茶与绿茶对该藻短期及长期的抑制作用,并通过比较茶叶干粉、水浸提液以及茶渣的抑藻效果提出合理的应用方法.试验结果表明,1 mg/mL的绿茶和红茶浸提液的5 h抑藻率分别高达(99.45±0.39)％ 和(1...     

孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减cDNA文库的构建及分析

利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulva pertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的消减cDNA文库.获得的阳性克隆经测序得到150条上调表达的EST片段,其中21条为冗余序列(RS),137条非冗余序列(NRS).片段中最长833 bp,最短106 bp,平均长度364 bp.参与比对的EST片段按照...     

塔玛亚历山大藻对海湾扇贝胚胎发育过程的影响

研究了塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）ATHK株对海湾扇贝受精卵孵化的影响,并探讨了可能的影响机制。将海湾扇贝受精卵暴露于不同密度的塔玛亚历山大藻ATHK中,观察其对胚胎孵化各阶段的影响,并利用光镜和透射电镜对实验组和对照组胚胎的外部形态和内部结构进行连续观察。结果表明：该藻对海湾扇贝受精卵孵化有显著的抑制作用,其IC50约为800 mL-1;2000 mL-1的ATHK延缓或破坏了胚胎的正常发育,胚胎内部出现大量溶酶体,原肠胚腔不能形成,且部分细胞出现胞质肿胀、线粒体自溶的现象,细胞不能进行正常的功能性分化;观察发现实验组中有些担轮幼虫的外形畸变,鞭毛发育迟缓;至24 h（D型幼虫）时,ATHK组中的D型幼虫数量远远低于对照组（P<0.05）,且死亡率明显高于对照组。观察还发现ATHK藻细胞和胚胎碰撞接触的现象,这种碰撞接触可能对有害物质的释放和转移有一定的刺激作用。     

海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选

利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段,将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109,构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定,电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后,选取10个阳性克隆进行测序和序列分析,有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性,初步判断为新的基因序列,3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。     

Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater

ABSTRACT:   The toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense (Lebour) Balech and A. catenella (Whedon and Kofoid) Balech produce potent neurotoxins, such as saxitoxin and gonyautoxin and have been mainly responsible for paralytic shellfish poisoning (PSP) in Japan. To prevent a negative effect on the fishery industry, it is necessary to identify these toxic species precisely and rapidly before and during the bloom. In this paper, a rapid and simple protocol of a fluorescence in situ hybridization (FISH) method using ribosomal RNA (rRNA)-targeted probes has been established for identifying the cultured strains and natural cells of A. tamarense and A. catenella . Using the FISH method established in this study, it was possible to identify these toxic species species-specifically and rapidly, within 30 min. The procedure of detection constituted three steps: (i) fixation/dehydration; (ii) hybridization; and (iii) washing; this made the identification simple. Moreover, this method did not require either special techniques or equipment, and the cost for detection was low. The specificity, rapidity, and simplicity of the developed method suggest that it might be useful for routine monitoring of these toxic microalgae.     

Distribution and abundance of resting cysts of the toxic Alexandrium spp. (Dinophyceae) in sediments of the western Seto Inland Sea, Japan

Sediment samples were collected from 135 stations in the western part of the Seto Inland Sea (Iyo Nada, Suo Nada, Beppu Bay, Tokuyama Bay, Hiroshima Bay, Aki Nada, Hiuchi Nada and Bingo Nada) to determine the horizontal distribution and abundance of resting cysts of Alexandrium spp. ( A. tamarense  +  A. catenella ). Enumeration of the cysts was performed using the primuline-staining direct count method. Cysts of Alexandrium spp. were rarely found in Iyo Nada, Suo Nada and Beppu Bay, but were widely distributed in Tokuyama Bay, Hiroshima Bay, Aki Nada, Hiuchi Nada and Bingo Nada. Cyst concentrations ranged from not detected (ND) to 14, ND to 17, ND to 4, 93 to 8137, 8 to 4454, ND to 6, ND to 18 and 4–29 cysts/cm³ wet sediment in Iyo Nada, Suo Nada, Beppu Bay, Tokuyama Bay, Hiroshima Bay, Aki Nada, Hiuchi Nada and Bingo Nada, respectively. The majority of cysts occurred in Tokuyama Bay and Hiroshima Bay, where higher densities were observed in the inner bay and along the coastal margin. Relatively higher cyst concentrations were observed at stations with a higher mud content. The abundance of Alexandrium spp. cysts in western Seto Inland Sea is lower than in the eastern Seto Inland Sea, except for Tokuyama Bay and Hiroshima Bay. However, because sporadic blooms of Alexandrium have been observed, continuing monitoring is necessary to prevent paralytic shellfish poisoning outbreaks in this area.     

黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析

应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝(Monopterus albus)Ⅳ期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以间期性腺为试验方,Ⅳ期卵巢为驱动方;反向差减杂交以Ⅳ期卵巢为试验方,间期性腺为驱动方.将获得的差减cDNA片段连接质粒载体,然后转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子.经PCR扩增鉴定插入片段范嗣为200～2000 bp.随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析,得到90个有效基因片段,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对.进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR,对文库质量进行验证.结果表明,所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的.黄鳝性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础.     

抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差异表达的基因

为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因,采用抑制差减杂交法,以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA,建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库,并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右,阳性率为81．8％。随机测定的45个克隆,在剔除假阳性克隆后,共得到22个不同的基因,其中13个为已知cDNA的同源基因,而另外9个为已知蛋白的同源基因,分别为prolactin receptor-like,COL1A1,M3-muscarinic receptor,Sfrs3,tropomyosin,ribosomal protein L27,ribosomal [rpteom S12,GAPDH,COL1A3。在所有22个基因中,COL1A1基因在差减库中的分布频率最高,为22．2％。RT-PCR检测结果表明,在所检测的11个基因中,所有基因在右眼移动前后的牙鲆头部均有表达,只是体现在表达水平上的不同。     

盐碱胁迫下青海湖裸鲤鳃基因表达差异

采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,研究了青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)在高盐碱胁迫下转录水平上的基因表达差异,实验获得差异表达序列91条,其中成功注释60条。以同是鲤科鱼类的斑马鱼(Danio rerio)的基因ID作为参照,用DAVID软件对这些序列进行功能分类,结果从正向文库获得28条功能基因片段,反向文库获得14条。按功能将其分为10类,其中,催化活性、细胞、部分结合相关基因表达上调,结合、免疫相关基因表达下调。分析发现,高盐碱胁迫会改变鱼类的渗透压和酸碱平衡,对免疫系统产生一定的抑制作用,对此,鱼类通过增强离子调控、提高血清尿素氮浓度、合成应激蛋白等,来维持渗透压和酸碱平衡,缓解应激反应。     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.