抗黄颡鱼“红头病”功能性蛋粉的制备及其应用

为了评价抗爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的特异性Ig Y的功能性蛋粉在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)"红头病"预防及治疗中的应用效果,采用灭活的爱德华氏菌(菌种保藏号:CCTCCNO:M2012024)免疫蛋鸡,通过微包膜及高速离心喷雾干燥技术制备抗爱德华氏菌的特异性Ig Y的功能性蛋粉,采用泼洒和口服两种方式检测该功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率。结果显示,所制备的功能性蛋粉抗体效价达到1∶5120;以剂量为2 mg/L功能性蛋粉连续泼洒水体3 d或以饲料重量0.2%的剂量口服14 d后,再用浓度为2.0×107CFU/m L的致病性爱德华氏菌对健康黄颡鱼进行攻毒,泼洒和口服功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率分别为85.5%和70.0%;对人工感染爱德华氏菌后患病的黄颡鱼养殖水体连续泼洒5 d或投喂14 d功能性蛋粉,其对黄颡鱼的免疫保护率分别为67.2%和40.7%,表明制备的功能性蛋粉对黄颡鱼"红头病"有很好的预防和治疗效果。     

3种黄颡鱼SOCSs基因分子特性及致病菌胁迫下的表达模式

细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)是JAK/STAT信号通路中细胞因子信号受体的重要抑制因子。为探究SOCS在鱼类免疫应答过程中的作用，本研究以杂交黄颡鱼“黄优1号”及其母本黄颡鱼和父本瓦氏黄颡鱼为研究对象，克隆了杂交黄颡鱼“黄优1号”3个免疫相关基因(SOCS1、SOCS2和SOCS3)，并对其生物信息学进行了比较分析；采用qRT-PCR技术研究了SOCS1、SOCS2和SOCS3基因分别在3种黄颡鱼感染嗜水气单胞菌和鮰爱德华氏菌后的表达模式。结果显示，杂交黄颡鱼“黄优1号”SOCS1、SOCS2和SOCS3基因的全长分别为561、735和672 bp，分别编码186、244和223个氨基酸，其预测的蛋白结构均含有保守的SH2结构域和SOCS盒。黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼“黄优1号”SOCS1、SOCS2和SOCS3基因的表达在被检的8个不同组织中呈现组织特异性。在两种致病菌感染后，杂交黄颡鱼“黄优1号”及其双亲的SOCS1、SOCS2和SOCS3基因在肝、鳃和头肾组织的表达量均在前24 h显著升高，随后逐渐恢复至正常水平。此外，鮰爱德华氏菌感染后，杂交黄颡鱼“黄优1号” SOCS1、SOCS2和SOCS3基因的表达量显著高于双亲，表现出较双亲更强的免疫调节能力且具有病原特异性。该结果为进一步解析黄颡鱼SOCS家族免疫防御调控机制提供了参考依据。     

一株黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌弱毒株的分离鉴定及特性分析

为探明湖北荆州市某养殖基地患病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)以烂身、腹水为主要症状且持续性死亡的确切病因，本研究对患病黄颡鱼进行了病原筛查，从患病黄颡鱼组织中分离到一株优势菌，经过形态特征、生理生化鉴定、16S rRNA测序和系统进化分析确定分离菌株为迟缓爱德华氏菌，命名为Et-4。结果显示：分离菌株Et-4具有较强的生物被膜形成能力，不携带esaV、fimA、gadB和katB四种主要的毒力基因。分离菌株Et-4人工感染健康黄颡鱼出现与自然发病类似的症状，并能从病鱼中再次分离出该菌，证实迟缓爱德华氏菌是引起此次黄颡鱼持续性死亡的致病原；分离菌株Et-4对黄颡鱼的LD₅₀为3.9×10⁶ CFU/g,结合毒力基因谱判定其为弱毒株。分离株Et-4携带耐药基因tet A、sulⅠ和add A1,对头孢类药物、庆大霉素、新霉素等敏感；对四环素类、青霉素类、万古菌素等耐药；中药抑菌实验表明乌梅和丁香对迟缓爱德华氏菌Et-4有明显的抑制效果。     

鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联表达外膜蛋白的免疫原性

采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3个时间点鳗鲡血浆中特异性抗体效价和同时期鳗鲡血浆、体表黏液、肝和肾组织匀浆液中的溶菌酶含量,同时检测3个时间点鳗鲡全血细胞的转化水平。免疫后28 d,嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌分别腹腔注射感染3组鳗鲡并测定其相对免疫保护率。结果表明,免疫后14 d和28 d,灭活菌和外膜蛋白免疫组的抗体水平均极显著高于PBS组(P0.01)。溶菌酶检测结果表明,不同处理组不同时间段血清、黏液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量存在显著(P0.05)或极显著(P0.01)差异。免疫后14 d灭活菌组全血细胞转化水平显著高于PBS和外膜蛋白组(P0.05),而21 d两个免疫组则均显著低于PBS组(P0.05)。活菌感染结果表明,灭活菌和外膜蛋白免疫后28 d对两株病原菌的攻毒相对免疫保护率均比PBS组提高了50%(P0.05)。本研究结果表明鳗鲡源嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物免疫日本鳗鲡后可提高鳗鲡的免疫功能及其对这两株菌的抵抗力,从而可能应用于鳗鲡基因工程疫苗的研发。     

黄颡鱼甘露糖受体基因的克隆和功能分析

甘露糖受体(MR)隶属凝集素超家族,主要表达于巨噬细胞和未成熟的树突状细胞表面。MR不仅在先天免疫防御中发挥重要作用,还通过参与抗原呈递,激活T淋巴细胞,启动获得性免疫应答过程。本研究采用同源克隆技术获得黄颡鱼甘露糖受体(pf MR)基因,采用荧光定量PCR技术检测MR在正常黄颡鱼体内的分布情况,采用鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞和甘露聚糖封闭MR方法研究黄颡鱼MR在抗细菌感染中的作用。结果显示,pf MR同团头鲂、草鱼、斑马鱼和尼罗罗非鱼的MR聚为一支。pf MR在所检测的12个组织中均有分布,其在肾脏、脾脏和肌肉组织中表达量较高,在血液中表达量较少。鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞后,pf MR、IL-1β和TNF-a均被细菌诱导表达,超氧阴离子和一氧化氮的含量也上升,超氧阴离子在感染30 min后即显著上升,一氧化氮在感染12 h后才显著上升。甘露聚糖竞争结合MR,显著抑制巨噬细胞内化GFP标签的鲖爱德华菌,加入EDTA减少内化的荧光强度,加入Ca~(2+)使内化的荧光强度回升。研究表明,黄颡鱼头肾巨噬细胞MR参与鲖爱德华菌的识别和内吞过程,而且依赖Ca~(2+)。     

养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(Bw)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(Bw)(6.4×103cfu/ind).综合该菌在形态与生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感.WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1:1 280.免疫后第6周.免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1:3 289.6).攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组.由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击.     

黄颡鱼IgM基因的个体发生和抗体的代间传递

为了解黄颡鱼IgM基因表达的个体发生和IgM抗体代间传递机制,实验利用Real-time PCR和ELISA等技术研究了黄颡鱼IgM重链基因在卵巢、胚胎和仔鱼的表达变化,以及黄颡鱼IgM抗体在卵巢、胚胎和仔鱼中的含量变化。结果显示,黄颡鱼3~7 d仔鱼中,没有检测到IgM mRNA;14 d仔鱼IgM基因开始表达。用细菌免疫亲鱼后,对仔鱼IgM mRNA表达没有影响。黄颡鱼IgM抗体在卵巢、胚胎和仔鱼中都有分布,且呈现下降趋势,至9 d仔鱼中抗体水平最低(是卵抗体含量的0.31倍)。14 d仔鱼中IgM抗体水平上升(是9 d仔鱼抗体含量的1.6倍)。用细菌免疫亲鱼后,能显著提高胚胎、仔鱼中的IgM抗体水平,在卵中抗体含量提高了2.3倍,9 d仔鱼中提高了1.8倍。研究表明,黄颡鱼IgM抗体可以在母本和后代之间传递,早期仔鱼IgM抗体主要来自于亲本;因此,免疫亲鱼能显著增加子代的抗体水平。     

斑点叉尾肠败血症(ESC)PCR诊断方法的建立

由爱德华氏细菌引起的肠败血症(ESC,又称爱德华氏病)是影响斑点叉尾养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病,本研究以NCBI公布的爱德华氏细菌eip基因(GeneBank登录号为AF037441)为模板序列,设计种特异性诊断引物,成功建立了用于斑点叉尾肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明,该方法能够直接从发病斑点叉尾脑、肝、脾和肾组织中检测到爱德华氏菌,检测的最低量为21个细菌;同时,该诊断方法与I型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交叉反应。临床样品检测证明,本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾肠败血症的快速诊断。     

鲖爱德华菌口服疫苗对斑点鲖的免疫效果

为评价鲖爱德华菌口服微球疫苗对斑点鲖的免疫效果,实验以天然高分子聚合物海藻酸钠和鲖爱德华菌灭活疫苗为材料,制备鲖爱德华菌口服微球疫苗。将实验动物随机分为鲖爱德华菌微球疫苗组、鲖爱德华菌灭活疫苗组、空微球组和对照组,以拌料口服方式进行免疫,通过检测血清中溶菌酶活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、补体替代途径(ACH50)活性等非特异性免疫指标,抗体效价以及相对免疫保护率评价疫苗免疫效果,采用荧光定量PCR检测口服疫苗对斑点鲖免疫相关基因表达量的影响。结果显示,鲖爱德华菌口服微球疫苗能够较长时间增强斑点鲖非特异性免疫功能;血清凝集效价于第5周达到峰值,为1∶16,免疫后第7周仍可检测到特异性抗体;口服鲖爱德华菌微球疫苗的斑点鲖获得的抗鲖爱德华菌相对免疫保护率为60.7%,远高于灭活疫苗组(14.3%)及空微球组(10.7%);荧光定量分析结果显示,攻毒后48 h相比攻毒前各免疫基因表达量均有上调,鲖爱德华菌微球疫苗对受免鱼肾脏、脾脏中免疫基因的表达影响尤为明显。结果表明,鲖爱德华菌口服微球疫苗能增强斑点鲖非特异性免疫功能,对鲖爱德华菌病起到一定的预防作用。     

杂交黄颡鱼、雄性瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的形体指数及肌肉营养组成比较分析

为评估商品规格杂交黄颡鱼的食用营养价值,对杂交黄颡鱼[Pelteobagrus fuividraco(♀)×P.vachelli(♂)]、雄性瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼商品鱼的形体指数、出肉率和肌肉的营养组成、氨基酸含量及脂肪酸组成进行了比较分析。结果表明,杂交黄颡鱼的肥满度与雄性黄颡鱼无显著差异;杂交黄颡鱼的胴体率、含肉率和脏体比均与雄性瓦氏黄颡鱼及雄性黄颡鱼无显著差异(P0.05)。杂交黄颡鱼肌肉水分含量最高,脂肪含量最低,而蛋白质和灰分含量与雌、雄黄颡鱼均无显著差异;雄性瓦氏黄颡鱼肌肉中水分、蛋白质和灰分的含量较低,脂肪含量最高;杂交黄颡鱼肌肉的氨基酸总量和7种人体必需氨基酸与黄颡鱼无显著差异(P0.05),但均显著高于雄性瓦氏黄颡鱼(P0.05);杂交黄颡鱼肌肉脂肪中C22:6n3的比例和n3系列不饱和脂肪酸总量的比例与雌性黄颡鱼无显著差异(P0.05),但均高于雄性瓦氏黄颡鱼,均低于雄性黄颡鱼。试验表明,杂交黄颡鱼的体形和出肉率与雄性黄颡鱼一致,其肌肉为低脂蛋白食品,营养价值与黄颡鱼接近。