产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130的复合诱变原生质体选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW1－104为出发菌，在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，对原生质体进行复合诱变，对大量再生突变株进行筛选和淡水驯化，最终获得了高产、稳定的碱性蛋白酶产生菌SW2－104，在自来水培养基中能够大量产酶，产酶活力为3910U／ml。从而解决了黄海黄杆菌YS－9412－130低温碱性蛋白酶大规模工业化生产设备和产业化区域的局限性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备，对黄海黄杆菌YS－9412－130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发，通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌YS－9412－130生长与代谢的基本规律，证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度，确定其一系列数值，从而推导出细胞生长与产物合成的动力学数学模型。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌YS－9412－130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体DNA用Sau3AⅠ部分酶切后，低熔点琼脂糖回收2－10Kb的DNA片段，用Klenow大片段酶半补齐，与用SalⅠ酶切且半补齐的质粒pUC19连续后，转化E.Coli.JM109，构建基因文库。且酪蛋白平板法和酶联免疫吸附（ELISA）的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆（命名为pHH1）。序列测定分析表明，此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架（ORF）和上游基因调控序列。此片段编码由256个氨基酸组成的酶，计算分子量为83000Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS－9412－130基因组DNA。     

黄海黄杆菌YS-9412-130产酶发酵条件的优化

以产低温碱性蛋白酶的黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW2－104为培养菌株，进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量和接种龄等发酵条件的优化实验。实验结果证明，在以1％葡萄糖为碳源，以3.5％豆饼粉为氮源，无机盐：0.4%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.1%Na2CO3、0.2?Cl2，起始pH值7.0，接种12h种龄的种子4％，20℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培养36h，菌株产酶活性最高。     

一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究

自海水贝类中取样，经分离培养基和酪蛋白培养基复合培养，用检测蛋白酶产生水解圈和Folin-酚碱性蛋白酶活性测定相结合的方法从1000多份样品中初步筛到了产碱性蛋白酶活力高、性能优良的菌株YS－9412－130。对其初步研究结果表明，该菌只能利用有机氮源生长；在接近自然海水盐度、温度20℃、pH在7.0-9.0条件下，菌体生长和产酶较好。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌YS－9412－130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质，结果表明，羟基、咪唑基、ε－氨基及胍基均与酶活性有关，而羟基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌YS-9412-130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明，该酶由256个氨基酸组成，分子量为33000Dar，等电点pI为9.45，米氏常数Km为5×10-3mmol/L；酶的最适作用pH范围为9.5～10.5，最适作用温度30℃，具有一定的抗氧化稳定性。Ca2+、Mn2对酶有激活作用，而Hg2+、Ag+对酶有抑制作用。DFP、NBS严重抑制酶的活性,而同时该酶也能被EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。     

海水养殖废水中氨氮降解菌的诱变及培养条件

以蛋白酶产生菌ZS7、亚硝化细菌ZW38和反硝化细菌ZL5为出发菌株,经微波和亚硝基胍复合诱变,分别获得相应的高效菌株YS5、YW5和YL3.YS5菌株在37℃、pH6.8～8.0时,发酵产酶能力最强,蛋白酶活力为2.471×10<'3>U/ml,为出发菌株的2.2倍.亚硝化细菌YW5在37℃、pH 6.0～7.2时,亚硝酸盐的生成速率最快,为3.39 mg/(L·d),为出发菌株的1.5倍;反硝化细菌YL3在37℃、pH 6.0～7.2时,还原亚硝酸盐的速率最快,为3.05 mg/(L·d),为出发菌株的1.7倍.     

紫外诱变原生质体选育溶菌酶高产菌株的研究

以1株产海洋溶菌酶活性较高的菌株（S_12-86）为原始菌株，对其原生质体的制备、再生及紫外诱变育种进行了研究。实验所确定的原生质体的最佳制备条件为：菌株S-12—86培养18h，溶菌酶浓度为1．0mg／ml，在35℃下，酶解30min，原生质体形成率为97．6％，再生率为23．6％。同时实验所确定的原生质体诱变的适宜条件为：30w紫外灯下80cm照射120S。对大量再生突变株进行筛选，最终获得了1株遗传性能稳定的菌株R—J—i01，其产酶活力达到1808U／mg，比原始菌株（1290U／mg）提高了40％。     

海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒理学研究

应用NIH纯系小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验，探究海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒性作用及对人类的潜在危害。观察并计数嗜多染红细胞（PCE)与正红细胞（NRBC）的比值、微核率；染色体的畸变类型和畸变率，检测海洋低温碱性蛋白酶的诱变作用。结果表明，皮下注射环磷酰胺的小鼠，P／N比值＜1，微核率为22.97‰，染色体畸变率为18.32,与生理盐水（NS）对照组比较差异极显著（P＜0.01)，而海洋低温碱性蛋白酶各组小鼠微核率均＜4‰，染色体畸变率为0.19%-0.25%,与NS组比较无显著性差异（P＞0.05）。未见海洋低温碱性蛋白酶各组对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。     

黄杆菌属中的一个新种

由海产贝类中分离到一菌株YS-9412-130，为革兰氏阴性短杆菌、末端圆、有鞭毛、不能滑行运动、大小为0.4～0.7μm×1.0～1.5μm，裂殖生殖，不生成芽孢，胞内无多-β-羟基丁酸颗粒。菌落光滑，黄色、半透明，边缘完整。其色素无荧光，含类胡萝卜素，其正己烷提取液经光谱测定最大吸收峰为450nm。该菌生长的温度范围为0～25℃，最适为18～22℃，最高25℃(在25℃生长极弱或几乎不生长)。此菌株于pH7.0～9.0能生长，最适pH为7.5，耐6％NaCl，80μg／m1的链霉素或80μg/ml的氨卞青霉素。YS-9412-130菌株为好气菌，严格的有氧呼吸代谢,过氧化氢酶、氧化酶阳性和磷酸酶阳性,利用多种糖、水解淀粉但不分解纤维素、琼脂和几丁质。水解干酪素、胨化石蕊牛奶最后变碱。液化明胶试验阴性，还原硝酸盐；不产H2S和吲哚；MR和V．P．试验阴性；YS-9412-130菌株DNA中G+C含量为32.2mol％。该菌株的特征符合黄杆菌属的特征，但与此属中的其他种比较又有显著的差别，因此将其定为黄杆菌属一新种，命名为黄海黄杆菌（Flavobacteriumyellowseasp.nov）。     

Cloning and expression of the gene encoding an extracellular alkaline serine protease from Vibrio alginolyticus strain HY9901, the causative agent of vibriosis in Lutjanus erythopterus (Bloch)

A 750-bp internal fragment of the alkaline serine protease gene (asp) from the Vibrio alginolyticus strain HY9901 was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The flanking sequences of the 5'- and 3'- ends of the asp gene were characterized by reverse and nested PCR. Sequence analysis showed that the asp gene contained an 1893-bp ORF encoding 630 amino acids. The deduced amino acid sequence of the ASP (alkaline serine protease) precursor showed significant homology with several bacterial alkaline serine proteases. Expression of the asp gene in Escherichia coli and activity tests of the ASP indicated that the N-signal peptide of the ASP precursor was essential to autocatalyse and fold correctly the enzyme to obtain activity. The purified ASP was lethal for Lutjanus erythopterus with an LD(50) of 0.25 microg protein g(-1) body weight.     

紫外诱变选育高活性蛋白酶枯草芽孢杆菌及其降解饲料能力评价

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘底泥中分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC2为出发菌株,利用紫外诱变的方法培育蛋白酶活性高的枯草芽孢杆菌菌株,并评价其降解饲料的能力。结果表明:(1)经6次紫外诱变,突变菌株B38的透明圈直径(H)与菌落直径(C)之比(H/C值)达到6.42,提高了2.13倍;(2)福林酚法测得B38的蛋白酶活性为86.82 U/m L,是出发菌株BC2的3.14倍,但紫外诱变对B38纤维素酶活性影响不显著;(3)连续传代培养10代后发现B38产蛋白酶和纤维素酶能力保持稳定,证明诱变菌株具有较好的遗传稳定性;(4)利用凯氏定氮法评价B38降解饲料蛋白的能力,发现与BC2相比,B38降解饲料中可溶性蛋白的能力提高了2.57倍,而降解不溶性蛋白的能力变化不大。本研究诱变选育的枯草芽孢杆菌B38为开发优良的水产微生态制剂产品提供了重要的前提和基础。     

Transmission of protease genes into a protease-deficient mutant of Aeromonas salmonicida in river sediments

Abstract. The transformation of Aeromonas salmonicida with DNA fragments from bacterial cell-free sonicates was investigated with intraspecific, interspecific band intergeneric fish pathogenic bacteria including Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Pseiidomonas fluorescens and Vibrio anguillarum strains as donor bacteria. A phenotypic marker for transformation was extracellular protease production since a protease-deficient mutant NTG-1 induced from pathogenic A. salmonicida strain A-7301 by mutagenesis was used as a recipient. This mutant was non-pathogenic to rainbow trout. The mutant was incubated with each sonicate at 20°C for 20 days with a nutrient-poor medium containing a trace (5 μg/ml each) of both humic acid and tryptone in the presence of clean river sand (100 g/100 ml medium) corresponding with an environment of rivers. During the incubation, the survival of mutant NTG-1 cells was observed and protease positive NTG-1 cells were isolated from each culture. The protease production of the isolates was due to the transmission of protease genes of the donor strains. The activity of proteases produced by the transformants extra-cellularly was determined. These transformants induced with the sonicates of the parent strain, intraspecific strain and with the sonicates of the interspecific A. hydrophila strain were pathogenic to rainbow trout, whereas the transformants derived with the sonicates of the intergeneric strains P. fluorescens and V. anguiUarum showed non-pathogenicity, although all the donor strains, with the exception of the P. fluorescens strain, were pathogenic. These findings are interesting since they demonstrate that trausformation in A. salmonicida occurs with considerable ease even intergenencally and interspecifically, as well as intraspecifically in river environments, and that there is a large difference in the lethal toxicity of extracellular protease produced by these bacteria.