17α-羟基-20β-双羟孕酮诱导泥鳅排卵的效应

有关17α-羟基-20β双羟孕酮[17α-Hydroxy-20β-dihydroprogesterone(4 Pregnen-17α-20B diol-3one)](以下简称17α-20βP)对鱼类排卵效应及其生殖机理作用的研究,自七十年代以来,国外已开展了这方面的工作。Schuetz, A.(1974),Jalabert, B.(1978)和Jalabert, B.et al.(1978)曾论述过,用脑垂体促性腺激素(GTH)诱导鱼类卵细胞的成熟是通过中介物质性类固醇激素在起作用的。Jababert,B.(1976)叙述了用类固醇激素(17α-20βP)能诱发虹鳟鱼的卵细胞达到最终成熟。Montalembert.     

虹鳟排卵前后血清中性类固醇激素浓度变化的研究

对虹鳟(Salmo gairdneri)排卵前后血清17β-雌二醇(17β-E_2),睾酮(T)和17α-羟-20β-双氢孕酮(17α20βP)的含量进行了测定。17β-E_2从排卵前15天的18.1ng/ml急骤下降到排卵前3—6天的2ng/ml,并继续下降,至排卵时仅为0.9ng/ml。睾酮在虹鳟雌鱼血清中的含量很高,血清浓度从排卵前9天的峰值水平143.3ng/ml缓慢下降,排卵时为24.3ng/ml。17α20βP的血清浓度变化明显,排卵前15天,该激素浓度接近于基线水平或甚至低得不能被检测,排卵前9天开始迅速上升,到排卵前3天达到峰值350.6ng/ml,排卵时为302.2ng/ml。本研究进一步证实了17α20βP在鲑鳟鱼类卵母细胞最后成熟过程中的生理作用,是一种诱发卵母细胞成熟的类固醇激素。临排卵前,血清17β-E_2浓度的下降,可能调节了17α20βP大量分泌的时间;17α20βP的大量分泌是卵母细胞达到最后成熟和排卵不可缺少的一环。注射合成的大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)促性腺激素释放激素(s-GnRH)及其类似物(s-GnRH-A),诱发虹鳟血清类固醇激素17β-E_2,睾酮和17α20βP的变化趋势与自然排卵时的变化相类似。经注射药物诱发排卵的鱼,较对照组提早一周排卵,而且排卵较同步和集中。     

人工诱导花鳗鲡成熟过程中卵巢内6种性类固醇激素的含量及变化

本文采用超高效液相色谱—串联质谱(UPLC/MS/MS)方法,分析比较了成年花鳗鲡(Anguilla marmorata)经多次注射鲤鱼脑垂体(carp pituitary extract,CPE,20mg/kg.周)和人绒毛膜促性腺激素(hCG,300IU/kg.周)后,卵巢发育成熟过程中6种性类固醇激素的含量及变化。结果发现,睾酮(testosterone,T)、孕酮(progesterone,P)、雌二醇(estradiol-17β,E2)、雌三醇(estriol,E3)、17α,20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one,DHP)、17α-羟基孕酮(17α-hydroxyprogesterone,17α-OHP)在xBridge C18色谱柱上得到良好分离,在0～200ng/ml的范围内线性相关系数均大于0.99,检测限为0.1~0.2ng/g,回收率超过了89％,相对标准差均小于7.3%;注射激素后,6种类固类醇激素在花鳗鲡卵巢中的含量变化情况如下：第2次注射后,T, P, E2, E3, DHP, 17α-OHP的含量分别为0.27±0.05, 0.64±0.05, 0, 1.17±0.19, 0, 0ng/g; 第9次注射后,T, P, E2, E3, DHP, 17α-OHP的含量分别为0.73±0.13, 1.28±0.38, 1.27±0.27, 0.83±0.14, 1.50±0.59, 0.43±0.25ng/g; 第16次注射后,T, P, E2, E3, DHP, 17α-OHP的含量分别为1.17±0.14, 2.23±0.51, 5.59±0.96, 2.46±0.70, 2.29±0.65, 4.56±0.74 ng/g。结果表明,随着外源激素注射次数的增加,花鳗鲡卵巢中6种类固类醇激素的含量整体呈逐步增加的趋势,UPLC/MS/MS法能同时定量测定这6种性类固醇激素,具有灵敏、高回收率、稳定的优势。     

鲟鳇杂交的人工繁育技术

在8～13℃水温下，对达氏鳇、史氏鲟亲鱼注射DOS（自行研制）、17α-羟基-20β双羟基孕酮（17α-20βp），在水温16～18℃时注射促黄体素释放激素类似物（LRH—A），流水刺激，诱导亲鱼排卵、排精。效应时间为8～18h，催产率100％、杂交受精率93．7％。采用全人工饲料进行开口试验和苗种培育试验，并获得85．7％开口成活率和77．33％的育苗成活率。生长曲线表明：不论是体长还是体重，50日龄前增长缓慢，50～100日龄则速度增长较快。经100d饲养，平均体长达29．5cm，平均体重达72．54g。     

17α, 20β 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达内参基 因的筛选

本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z,CTSZ)、延伸因子1-α(elongationfactor 1-α,EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)、β肌动蛋白(β-actin)6个候选内参基因在17α,2β双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况,并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析.Bestkeeper软件分析表明EF-1α的变异系数和标准差是6个候选内参基因中最低的,且Bestkeeper指数在6个候选内参基因中最高,说明其表达稳定性最高,适合做为内参基因;geNorm软件分析认为需要同时使用EF-1α和CTSZ两个内参基因来校正目标基因的表达;NormFinder软件分析同样表明EF-1α是6个候选内参基因中表达最稳定的;最后通过RefFinder软件综合比较分析,确定EF-1α相对于其他5个候选内参基因,在17α,20β双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定,可作为内参校正17α,20β双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况.     

17α-甲基睾酮对赤点石斑鱼性逆转的影响

采用腹部埋植方式,用17α-甲基睾酮(17-αMT)以10mg.kg-1剂量处理2龄雌性赤点石斑鱼(每4周埋植1次,共埋植2次),检查埋植前后性腺结构、血清中性类固醇激素水平以及脑和性腺芳香化酶活性的变化。结果显示:一次埋植17-αMT即可诱导赤点石斑鱼发生不同程度的性逆转,性腺成熟系数(GSI)明显下降,性腺中卵细胞退化,精原细胞增殖,出现大量精母细胞和精子细胞,性逆转雄鱼精巢的组织结构与正常雄鱼精巢相似,部分鱼转变为功能性雄鱼,经轻微的腹部挤压可排精,精子活力与正常雄鱼相似。赤点石斑鱼埋植17-αMT后前脑、中脑的芳香化酶活性明显提高而后脑的芳香化酶活性降低,但性腺芳香化酶活性无显著变化。埋植17α-MT后第4周血清中11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT)浓度显著升高,而睾酮(testosterone,T)和雌二醇(estradiol-17,βE2)浓度变化不显著。这些结果表明,脑部芳香化酶活性的显著升高与性逆转密切相关,17-αMT主要通过提高血清中11-KT水平诱导赤点石斑鱼发生性逆转。     

香鱼性成熟期间血浆中固醇类激素水平的变化

由放射性免疫测定法测定雌鱼性成熟的各时期中雌二醇——17β、17α——羟孕酮和17α、20β——二羟——4—pregnen——3——酮(170、20β——diOHprog)的血浆水平。在卵黄生成期间雌二醇——17β增加,而在次级卵母细胞成熟以前迅速减少,继之在排卵和产卵期间出现第二次增长。雌二醇——17β的第二次增长可能同残留的卵黄卵母细胞有联系。卵巢成熟的多数时期中血浆17α——羟孕酮曲线和17α、20β——diOHproy的曲线相同。这两种类固醇在卵黄原阶段始终很低,然而在排卵和产卵期间却急剧升高,之后又很快降至基础水平。17α——羟孕酮的显著增加在采最终成熟雌鱼的血浆中十分明显。然而直至排卵时17α、20β——diOHprog也无显著增加。由此想列17α——羟孕酮可作为17α、20β——diOHprog的一个预兆。这一结果为17α、20β——dioHprog是香鱼体内天然的催熟类固醇进一步提供了依据。     

鲟、鳇鱼人工繁育与杂交技术研究

对达氏蝗、史氏鲟人工繁殖时通过水流刺激，在水温8～13℃下，以DOS(自行研制)进行2～3次的注射催熟，再注射自制的类固醉激素17α—羟基—20β双羟基孕酮(以下简称17α—20βp)；在水温16～18℃利用促黄体家释放激素类似物(LHRH—A)，诱导达氏蝗、史氏鲟排卵，排精。效应时间8～18h，获得催产率100％、受精率和杂交受精率如％的效果。采用全人工饲料开口试验和苗种培育试验，并获得86．7％开口成活率和73．4％的苗种成活率。从而达到提高开口率和成活率的目的。观察鲟鲤鱼摄食、生长与形态发育状况。生长曲线表明：不论是体长还是体重，50日龄前增长缓慢，50～100日龄则速度增长较快。经100d饲养，平均体长达28．3cm，平均体重达69．7g。     

促性腺激素诱发大西洋鲑卵黄发生期卵巢滤泡释放性类固醇激素的离体研究

提要应用大麻哈鱼(Oncovhynchus keta)促性腺激素(GTH)诱发大西洋鲑(Salmosalar)卵黄发生期的离体卵巢滤泡(直径为3．4毫米)产生性类固醇激素的研究表明，不论用0．1或1微克／毫升GTH刺激，经培育10天后，未出现卵母细胞卵核消失的现象，卵核偏位也不明显。对培养液中17α，20β-双羟孕酮(17α20βP)的积累浓度测定结果，仅1微克／毫升GTH组含少量的17α20βP；0．1微克／毫升GTH组，培养液中雌二醇的积累浓度明显高于对照组和1微克／毫升GTH组，并为后者的两倍。除雌二醇外，孕酮，17α-羟孕酮，17α20βP，雄烯二酮和睾酮的产生，都呈现对GTH剂量的依赖关系，1微克／毫升GTH组的产生量明显高于0．1微克／毫升GTH组和对照组。离体研究的结果表明，处于卵黄发生期的卵巢滤泡对低剂量(0．1微克／毫升)和高剂量(1微克／毫升)GTH的反应不同。低浓度的GTH，引起性类固醇激素生物合成的途径沿着形成雌二醇的方向进行，雄激素被芳香化成雌激素，雌二醇再而刺激肝脏合成卵黄物质的前体，从而促进卵黄发生。高浓度的GTH，有抑制雌二醇合成的作用，而是促使卵母细胞向着最终成熟的方向发展，使性类固醇生物合成的途径转向形成大量雄激素和孕激素，特别是17α20βP。这与已充分生长和卵黄积累完成的卵巢滤泡离体试验的结果一致，与活体观察以上各种性类固醇激素的变化一致。     

达氏鳇人工繁殖及其与史氏鲟杂交的初步研究

对达氏鳇繁殖生物学作了分析,认为卵巢重量随体重的增大而增大.成熟卵子呈黑色,卵外膜色泽光亮,而未成熟卵子为灰黑斑色,卵外膜色泽暗淡.其怀卵量明显小于史氏鲟,而卵粒重却大于史氏鲟.人工催情利用抗低温催情剂类固醇激素17α-羟基-20β双羟孕酮诱导达氏鳇排卵,排精,并与史氏鲟进行了正反杂交,获得产卵率75%和杂交受精率73-91%的效果.