刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病，导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板，PCR扩增出16s-23s间隔区序列，将该片段克隆进pMD19-T Vector，转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物，合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性，而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性；探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测，其检出率均为100%。研究结果表明，该探针具有良好的特异性和敏感性，可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次，它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原——灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失.根据其主要致病原灿烂弧菌(VibrioQQQsplendidus)的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究.结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.Fluvialis、V.Anguillarum、V.Alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.Harveyi、V.Parahaemolyticus、V.Vulnificus的DNA均无交叉反应.应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%.研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌.在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法.     

养殖刺参“腐皮综合征”致病菌——灿烂弧菌的原位杂交检测方法的建立与应用

以养殖刺参“腐皮综合征”的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S~23S间隔区序列，设计特异性引物，用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针，建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法，并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示，感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性，而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中，阳性信号（显色）强弱清晰，能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度，这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础，也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。     

养殖刺参腐皮综合征 2 种致病菌间接荧光抗体快速检测方法

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明:采用IFAT可以对刺参腐皮综合征2种致病菌进行准确快速的检测。该方法的建立对刺参腐皮综合征的流行病学调查及快速诊断具有重要意义。     

仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌RPA-Cas13a检测方法的建立

为预防和控制灿烂弧菌引发的仿刺参腐皮综合征，促进仿刺参养殖业的健康可持续发展，利用LwCas13a中特异性CRISPR RNA(crRNA)与靶RNA结合后可激活Cas13a蛋白对外源RNA分子附属切割活性的特征，结合重组酶介导的聚合酶扩增技术(RPA),建立1种针对灿烂弧菌gyrB基因的快速、灵敏、特异的定量检测方法——RPA-Cas13a。RPA-Cas13a可实现在37℃恒温下、60 min内对灿烂弧菌的快速实时检测。灵敏度测试结果显示，RPA-Cas13a检测限为550拷贝/μL(gyrB),与荧光定量PCR的检测灵敏度水平一致；特异性测试结果表明，RPA-Cas13a对创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等其他弧菌及产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等常见水产动物病原菌均无交叉反应，特异性较强。RPA-Cas13a方法对仿刺参体表黏液(32份)、养殖池塘水体(15份)和表层沉积物(10份)等57份环境样本的阳性检出率为8.77%,与传统荧光定量PCR方法的检出一致性高(Kappa=1.00),无统计学差异(P>0.05)。试验结果表明，灿烂弧菌的RPA-Cas13a...     

养殖刺参腐皮综合征病原菌的分离与鉴定

2003年春季，山东省青岛地区刺参养殖场暴发了较为严重的传染性疾病一“腐皮综合征”，该病引起的死亡造成约30％的损失。养殖刺参的发病症状表现为：厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。从患病个体溃疡部位分离得到一种优势细菌KL-1，KL-1经人工回接感染实验证明对健康刺参具有较强的致病性，且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明，导致养成刺参“腐皮综合征”的致病菌是灿烂弧菌（Vibrio splendidus）。本文首次揭示了该地区“腐皮综合征”导致养成刺参大规模死亡的致病原因，对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

几种消毒剂对养殖刺参"腐皮综合征"主要致病菌杀灭试验的研究

刺参“腐皮综合征”（俗称化皮病）是当前养殖刺参的最主要疾病,死亡率可达90%以上,属急性死亡,越冬保苗期幼参和养成期海参均可被感染发病。经研究证实,灿烂弧菌Vibriosplendidus和假交替单胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens是该病的主要致病原。作者通过漂粉精、溴氯海因、PVP-I、过氧化氢、双链季铵盐络合碘和生石灰6种消毒剂对灿烂弧菌和假交替单胞菌的定性杀灭实验发现,上述6种药物对腐皮综合征的病原菌都有明显的杀灭作用。     

福建海区网箱养殖刺参“腐皮综合症”病原分析与鉴定

2011年冬季,福建省宁德市霞浦县海区网箱养殖刺参发生"腐皮综合症",并伴有死亡现象出现。刺参的发病症状表现为:厌食、排脏、身体萎缩、体表局部溃烂乃至大面积溃烂。从患病刺参病灶处分离得到两种优势细菌CS1和CS2。经人工回接感染实验证明两种菌对健康刺参都具有较强的感染性,且感染病参的症状与自然发病刺参的症状相同。通过生理生化试验、16S rDNA序列分析及系统进化树分析,结果表明两株菌分别与灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)相似。菌株CS1与灿烂弧菌的亲缘关系最近,相似率达到99%,菌株CS2与假交替单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到95%。菌株CS1可鉴定为灿烂弧菌,菌株CS2可鉴定为假交替单胞菌。另外,在患病刺参呼吸树膜和腔体内发现大量后口虫(Boveria sp.)。所以导致本次刺参"腐皮综合症"的原因可能是致病性细菌和寄生虫共同作用的结果。本文首次揭示了该地区"腐皮综合症"导致养成刺参大规模死亡的致病原因,对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

低温期养殖刺参腐皮综合征的发生与环境因子间的关系

为研究低温期养殖刺参腐皮综合征的发生与环境因子之间的关系,2006年1-5月在青岛周边地区3个养殖场刺参腐皮综合征发生的早期,采用异养菌总数TSB平板计数法、弧菌TCBS平板计数法对发病池塘的水质和池塘中异养菌总数和弧菌总数的数量与分布以及刺参肠道中的异养菌总数和弧菌总数进行了研究,同时比较研究了刺参病灶组织中优势菌与池塘环境及刺参肠道中优势菌的相关性.结果表明:发病池塘水体中细菌的数量较少,但底层水体中细菌总数普遍多于表层,水体中的优势菌与刺参病灶组织中的优势菌相关性不大;池塘表层底泥和刺参肠道中异养菌总数较多,弧菌总数较少,其优势菌与刺参病灶组织优势菌具有一致性.刺参腐皮综合征的发生与池塘水体分层引起的水质恶化和底泥中异养菌的数量密切相关.     

刺参腐皮综合征防治措施

<正>21世纪以来，刺参养殖在我国蓬勃发展，现已成为我国北方沿海地区的重要经济养殖品种之一。但随着刺参养殖业的快速发展，各种病害频繁发生^[1]。刺参养殖主要的病害有腐皮综合征、化板症、烂胃病、盾纤毛虫病等，其中腐皮综合征发生频率较高，危害较大。腐皮综合征又称“溃烂病”“烂皮病”“化皮病”，多发生在1—4月，其中2—3月为发病高峰。幼参到成参均可发病，幼参发病率更高，     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

Estimation of variation of virulence of Renibacterium salmoninarum by survival analysis of experimental infection of salmonid fish

The variation of virulence of Renibacterium salmoninarum , the causative agent of bacterial kidney disease (BKD) in salmonid fish, was studied by infecting rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with two isolates (strains 325 and 932) from diseased Atlantic salmon, Salmo salar L., and one isolate (strain 4366) from an apparently healthy Atlantic salmon. Coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), were injected with the strain 932 to estimate difference in fish species resistance. Fish were removed by random sampling for other study purposes, a study design possible with analysis of lifetime distributions incorporating both sampling-, death- and survival-times. At the end of the experiment, the rainbow trout infected with strains 325, 932 and 4366 had a survival probability of 33%, 51% and 72%, respectively. The coho salmon infected with strain 932 had a 26% survival probability. The strain differences were significant according to the log-rank test, and the risk ratio between the strains ranged from 1·8 to 5·4. The strain from the apparently healthy fish was least virulent. The survival of the fish species was different over time. Rainbow trout were more likely to die early in the time course, but high numbers of coho died later, resulting in an overall risk of mortality of 1·4 in favour of rainbow trout. Differences in virulence may reflect changed selective pressure on R. salmoninarum when introduced from feral stocks into the environment of fish farms.     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids

Anti-proteinase activity was demonstrated in the seminal plasma of cyprinid fish species (bream, chub, ide, dace, asp, goldfish, roach, common carp) using electrophoretic techniques combined with a detection method based on inhibition of bovine trypsin. We found species-specific protease inhibitors in the seminal plasma of cyprinids. At least three bands of protease inhibitors with different migration rates could be identified by native PAGE. Higher variability was characterized for bands with slower migration rates. Visualization of inhibitors after SDS-PAGE under non-reducing conditions allowed estimation of their molecular weights. Apparent molecular weights were within the range of 51–59 and 47–54 kDa for the bands with slower and moderate migration rates, respectively. The molecular weight of fast migration bands for roach and common carp were estimated to 23 and 30 kDa, respectively. Inhibitors of common carp seminal plasma differed in their affinity toward serine proteases. Three inhibitors in common carp seminal plasma could be visualized using cod and bovine trypsin, but only two inhibitors (of high molecular weight) were recognized with chymotrypsin. There were differences in anti-proteinase activity and seminal plasma protein concentration in relation to the origin of common carp seminal plasma (breeding lines) and time of milt collection (spawning vs. post-spawning season).     

金鳟、虹鳟苗种长途运输实例

鳟鱼发眼卵和旨种运输是养鳟生产的重要环节。发眼卵多在冬季和早春运输，苗种多在晚春和夏季运输。苗种运输大多以鱼篓充氧进行短距离汽车运输，长途运输冷水性鱼苗种的实例很少。本文总结了金鳟和虹鳟苗种长途运输方法，以期与养鳟业界共同交流提高。一、包装材料和方法内包装材料是苗种运输专用塑料袋，规格54×104cm，外包装是泡沫塑料箱，规格63.5×45.5×30．5cm，纸箱规格64×46×32．5cm。塑料袋采取双层式，内装苗种和水共12.5kg，其中苗种0.5-1．3kg，100－2000尾。起运前苗种停食1－2天。运鱼用水水温调至6℃，鱼、水入袋后袋内…     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

不同年龄细鳞鱼的繁育效果

研究了不同年龄组(3～8龄)细鳞鱼(Bachymystax lenok Pallas)亲鱼的繁育效果,分析其繁育主要技术,包括亲鱼培育、繁育技术、受精卵孵化、鱼苗培育等,结果发现,5～6龄和7～8龄细鳞鱼产卵量没有明显差异,产卵量、孵化率、出苗率均较高,繁殖效果明显好于3～4龄亲鱼。     

海口市近海渔业资源衰退的原因分析与对策建议

在分析海口市海洋渔业资源和海洋捕捞现状的基础上，提出了近海渔业资源衰退的6项原因和加快保护和修复资源的10项措施和建议。     

鱼类热忍耐温度研究进展

The paper is a review of the studies on the temperature of the thermal tolerance in fishes. It was described from four aspect: (1) The key parameters of temperature of thermal tolerance in fishes; (2) The influence factors of temperature of thermal tolerance in fishes; (3) The research methods of thermal effect of fishes; (4) The evaluation of effects of thermal pollution on fishes, especially, with the coastal power station will be‘built in China recent years, the effects of thermal discharge water on the marine fisheries resource wered iscussed.