3种野鲮亚科鱼类16SrRNA基因序列分析

野鲮亚科(Labeoninae)隶属鲤形目(Cypriniformes)中的鲤科(Cyprinidae,约有26个属近300个种。为研究其在鲤科鱼类中的系统发育关系,以16S rRNA基因作为遗传标记进行鲤科鱼类的系统发育分析。通过PCR方法, 扩增了长度为361-362 bp的3种野鲮亚科鱼类的16S rRNA基因部分序列,序列比对得到364个排列位点,其中94个为信息位点,占全部位点的26.8%。用Mega 2.1软件的NJ法构建分子系统树,结果表明:野鲮亚科鱼类没有形成单系类群,野鲮亚科的鲮、角鱼与鲤亚科的鲤、鲫形成姐妹群,然后再与野鲮亚科的麦鲮和露斯塔野鲮聚在一起,说明鲮与鲤亚科鱼类具有较近的亲缘关系。     

卵形鲳!线粒体１６ＳｒＲＮＡ基因全长序列的克隆与分析

根据近源物种线粒体序列的同源比对，在16S rRNA基因上下游保守区域设计一对通用引物。PCR扩增获得特异的DNA片段，经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体16S rRNA全长序列1725bp。对5个个体分别测序后比对，发现卵形鲳鲹16S rRNA基因在钦州湾种群个体间存在至少7个变异位点，使5个个体分别具有5种不同的单倍型。将卵形鲳鲹和鲹科其它物种的16S rRNA序列进行比，根据比对结果构建的鲳鲹科各物种的系统进化树，支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科，鰤亚科，鲳鲹亚科，鰆鲹亚科)的分类系统。综上所述，16S rRNA基因既可用于卵形鲳鲹种群遗传多样性分析，又适用于鲹科鱼类的系统进化分析。     

水环境细菌病原数据库的构建及应用

水环境病原菌对人类和水生动物的健康以及水产品生物安全带来了重大威胁,是公共卫生、水产养殖、食品安全等行业的重点监测对象。然而水环境病原菌数据库建设相对滞后,相关数据库分散在临床医学和水产动物病害等领域,且缺乏信息交流与融合,完整性仅限于各自独立的学科,不能满足区域尺度或生态学视角下,大规模水源性病原鉴定及生物安全评价等高通量监测的需求。因此,本研究通过整理人类介水传染病、水生动物、哺乳动物、植物和跨宿主疾病等7大类细菌病原信息,构建多线程可调度通讯模型和全局序列匹配算法,开发了水环境细菌病原数据库(DPiWE,dayuz.com)。DPiWE收集了14门、27纲、54目、116科、221属、1 097种、9 070株细菌病原的物种分类、16S rRNA基因、宿主(195种)和感染类型(21种)信息。并在Web端实现信息检索、序列比对和注释结果可视化等功能。案例分析显示,DPiWE构建的系统发育网络,清晰地将养殖环境菌株DS10-D19划分为鳆发光杆菌;用DPiWE对海水混养系统细菌高通量测序结果进行注释,揭示3种养殖动物病原分布具有明显差异,患病组水体有传播人体和鱼类共患病病原的风险。DPiWE及配套分析流程可为水环境生物安全高通量评价、渔业生态健康维护和水产动物病害个性化防治提供新的思路和数据基础。     

硬骨鱼类线粒体基因系统发育信息效率分析

采用PCR产物直接测序法获得圆斑星鲽（Verasper variegatus）和条斑星鲽（V．moseri）线粒体基因组的全部基因序列，并从GenBank中下载已知分类地位相关鱼类的线粒体基因的核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列，用蛙、鸡、牛做外群，采用NJ和MP法，重建鱼类的系统发育树。通过计算各个基因在重建系统发育树时的准确率，估算该基因所含有的系统发育信息。结果表明，从氨基酸序列和核苷酸序列以及在目、科、属综合分析，这些基因的系统发育信息大致分为好（16S rRNA、ND2、ND4、12S rRNA、ND6、ND5）、中（Cytb、COII、COIII、ND1、COI）和差（ND3、ND4L、ATP6、ATP8）3个组。在目阶元，当用核苷酸序列分析时，12SrRNA、16SrRNA、COII、ND4、ND5和ND6最好，COI、COIII、Cytb、ND1和ND2为中等，而ND3、ATPase6、ATPase8和ND4L最差。当用氨基酸序列分析时，ND4和ND5最好，ND1、ND2、Cytb、ND6、COI、COII和ND4L为中等，ND3、ATPase6、COIII和ATPase8最差。在科阶元，当用核苷酸序列时，12SrRNA、16SrRNA、ND2和ND6系统发育信息最好；用氨基酸序列时，Cytb和ND2最好。在属阶元，所有基因的核苷酸序列都具有很好的系统发育信息，而COII、ND4L、ND1和ND3的氨基酸序列系统发育信息最差。本研究结果有助于进一步利用线粒体基因研究分析鱼类系统进化关系。     

GenBank中裂腹鱼类COI基因序列的分子标记有效性

裂腹鱼类(Schizothoracids)分布有复杂的水系格局, 在形态学鉴定时有些鱼种容易混淆。线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 I(CO I)基因是动物学研究中常用的物种分子条形码, 分析 GenBank 数据库中裂腹鱼类 CO I 作为分子标记的有效性, 可以加深理解和认识前人用这些数据所做的研究工作, 也为今后更合理地使用这些数据提供参考依据。本研究对 GenBank 数据库中裂腹鱼类 CO I 基因的分子标记有效性进行分析评估, 通过同源性比对、参考序列间遗传分歧的估算和系统发育关系重建等方法, 判断 GenBank 数据库中裂腹鱼类 CO I 基因序列的同源性、序列所属鱼种鉴定的准确性, 以及序列信息对系统发育关系的解析力。通过对下载的 1431 条序列进行多重比对发现, 有 3 条序列与其他序列存在显著差异, 同源性存疑, 数据信息经 BLAST 相似性搜索和核查确认为, 以 CO I 基因的互补链形式提交的序列, 比对前应先进行互补链转换。全部序列的比对结果显示, GenBank 数据库中裂腹鱼类的 CO I 基因片段序列均为该基因近 5?端至中部的序列。权衡序列的数量和长度后, 舍弃较短的 35 条序列, 保留长度为 527 bp 的 1396 条序列进行分析, 结果共定义了 228 个单倍型, 在有多条序列的鱼种中, 普遍存在种内共享单倍型, 还有 41 个单倍型为种间共享。裂腹鱼类 CO I 单倍型的平均 p-距离为 9.5%, 与鱼类的属级水平相当, 原始、 特化和高度特化类群各自的平均 p-距离值更低, 体现近期辐射演化的特征, 可能与它们随着青藏高原演化成种的历史较短有关。GenBank 中一些裂腹鱼类 CO I 基因序列的鱼种鉴定存在错误, 在使用时应先与参考序列对比, 或从系统发育分析的角度做出判断。总体来看, CO I 基因序列能够有力解析裂腹鱼类各演化等级裂腹鱼类之间的亲缘关系, 可用于分类和演化的初步分析。结合形态学、生态学、线粒体和核基因的多样性及系统发育关系等进行综合分析, 将有助于更准确地界定裂腹鱼种类, 同时也为深入探讨杂交和成种过程等问题奠定基础。     

Cyt b和12S rRNA基因条形码在灯笼鱼科鱼类物种鉴定中的应用

灯笼鱼科鱼类种类繁多, 且同属鱼类形态学相近, 因此利用分子标记对灯笼鱼进行准确的物种鉴定具有重要价值。为探讨线粒体细胞色素 b 基因(Cyt b)和 12S rRNA 基因在灯笼鱼科物种鉴定中的适用性, 对西北太平洋采集的 56 尾灯笼鱼进行扩增, 并进行序列对比与系统发育分析。研究表明, 采集的样本包括 6 种灯笼鱼, 分别为瓦氏角灯鱼(Ceratoscopelus warmingii)、长体标灯鱼(Symbolophorus californiensis)、粗鳞灯笼鱼(Myctophum asperum)、 细泰勒灯鱼(Tarletonbeania crenularis)、日本背灯鱼(Notoscopelus japonicus)以及某背灯鱼属鱼类(Notoscopelus sp.)。 核苷酸多态性分析显示, 基于 Cyt b 基因的种内与种间遗传距离比基于 12S rRNA 基因的更大。比较灯笼鱼科 2 种基因序列的结构特征, 发现 Cyt b 基因的种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的 25 倍, 12S rRNA 基因的种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的 26 倍, 均符合作为 DNA 条形码的基本要求。系统进化分析显示, 每种灯笼鱼均能形成独立分支, 2 个基因均能对 6 种灯笼鱼类进行鉴别; 但在 Cyt b 基因构建的进化树中, 每种鱼类能更好与数据库中已有的序列进行聚类。综上所述, Cyt b 和 12S rRNA 作为 DNA 条形码可以有效地对灯笼鱼科鱼类物种进行鉴定, 且 Cyt b 基因在系统进化关系的研究上具有更高的适用性。     

中国近海11种鳀科鱼类分子系统发育的初步研究

以鳀科鱼类为研究对象,分析其线粒体16S rRNA基因片断序列,探讨了5属11种中国鳀科鱼类的亲缘关系。得到16S rRNA可比序列长度为472~501 bp,共存在20个插入/缺失,125个变异位点。总体上看,序列中转换多于颠换,转换/颠换之比为1.4。根据16S rRNA基因片段差异计算的种间遗传距离从0.22%(黄吻棱鳀和中颌棱鳀,刀鲚和凤鲚)到18.54%(长颌棱鳀和康氏侧带小公鱼),以金色小沙丁鱼作为外群构建的系统树,棱鯷属依次与鲚属、黄鲫属相聚,再与棱鳀属的赤鼻棱鳀相聚;最后与鳀属和侧带小公鱼属形成的分支相聚。赤鼻棱鳀自成单独的一支,建议将赤鼻棱鳀从棱鳀属中划分出来。     

基于16S rRNA部分序列探讨12种鲹科鱼类的分子系统进化关系

鲹科鱼类在传统形态分类与分子遗传水平构建的系统分类存在争议，本文通过PCR扩增获得了鲹科（Carangidae）8属9种的线粒体16S rRNA基因片段序列约598bp碱基，结合来自GenBank的3种鲹科鱼类的相应片段序列，并以大斑石鲈Pomadasys maculates为外群，生成供系统发育分析的序列矩阵，利用MEGA version 3.0软件分析序列的碱基组成、差异百分比和转换/颠换值等，应用最大简约法和邻接法构建系统树。结果显示：（1）支持鲹科下设四个亚科（鲹亚科，鰤亚科，鲳鲹亚科，鰆鲹亚科）阶元的分类系统；（2）所测种类鲹亚科鲹属下不宜设亚属分类阶元；（3）及达副叶鲹与丽叶鲹亲缘关系近，16S rRNA基因片段序列碱基只有1.07%的差异，未达到分属水平，应同属于副叶鲹属的两个不同种，并建议丽叶鲹的中文名用“丽副叶鲹”。     

以重复序列为靶位点的鳜鱼多位点基因打靶载体的构建

以鳜鱼(Siniperca chuatsi)为研究对象，以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LA Taq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2，经T质粒克隆后，分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游，构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeo-HRDS1／2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向，最终构建成多位点基因打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2-hIFN。目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性等问题，以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题。     

海南三亚斑节对虾野生种群mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列的多态性

采用聚合酶链式反应(PCR)技术对海南三亚野生斑节对虾(Penaeus monodon)20个个体的mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列进行扩增,PCR产物经纯化后进行测序,得到16S rRNA基因的495 bp的核苷酸序列和控制区序列470 bp的核苷酸片段。用Clustal X软件对16S rRNA和控制区序列进行了比对,通过ARLEQUIN 2000软件对所得线粒体16S rRNA基因片段和控制区序列进行了比较分析。16S rRNA序列检测出17个多态位点,8种单倍型；控制区序列检测出100个多态位点,17种单倍型。该种群16S rRNA序列基因多样度(H)和碱基多样度(π)分别为0．700和0．0045；控制区序列的H和π分别为0．984和0．0480。研究结果表明：16S rRNA序列不适应斑节对虾的种群遗传多样性分析；控制区序列适应斑节对虾种群遗传多样性研究。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

低氧胁迫下中华圆田螺的肝脏转录组学分析

为了探究低氧胁迫下中华圆田螺(Cipangopaludina cathayensis)肝脏组织基因的差异表达，本研究通过高通量测序技术，分析中华园田螺低氧胁迫组(2.5 mg/L)和常氧组(6.9 mg/L)某些基因的差异表达，并对差异基因进行生物信息学分析，进一步采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对关键差异表达基因进行验证。结果显示，测序共获得232 379条基因(unigenes)，与对照组比较，低氧胁迫组筛到176个差异基因，包含64个上调基因和112个下调基因。GO功能注释分析显示，差异基因主要富集在生物学过程中的几丁质代谢过程和含氨基葡萄糖的复合代谢过程，细胞组分中的胶原三聚体成分，分子功能中的几丁质结合功能和糖衍生物结合功能。KEGG通路富集分析显示，差异基因主要集中于环境信息处理、遗传信息处理、代谢和生物系统这4大类通路。6个关键差异基因的RT-qPCR结果显示，热休克蛋白70B2和热休克蛋白β-6基因表达量上调，几丁质酶蛋白4、α-1胶原蛋白(XIV)、α-4胶原蛋白(XIV)、5-磷酸酶蛋白基因表达量下调，证实了转录组测序结果的可靠性。本研究发现，低氧胁迫激活了中华圆田螺适应缺氧的生理活动，并获得了低氧胁迫下中华圆田螺肝脏组织中相关功能基因的表达信息，为深入研究中华圆田螺响应低氧胁迫的调控机制提供了基础数据和理论依据。     

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及定居因子抗原基因检测

2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。     

鳜传染性脾肾坏死病毒的纯化和酶切分析

鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原，本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ISKNV病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为150mm，抽提病毒核酸，对其基因组DNA进行酶切分析，病毒基因组为双链DNA分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶5′端高度甲基化，以限制性内切酶EcoRI、BamHI、HindⅢ、KpnI和PstI酶切ISKNV基因组DNA，经电泳分离后，分别得到1、8、9、18、22条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过108.7kbp。     

水产群体基因组重测序数据分析软件包的开发

为了帮助水生动物学研究者解决群体遗传学基础分析的困难，本实验在调研现有的水生动物重测序数据分析研究和成果的基础上，基于水生动物群体遗传学的常用方法和通用分析软件，构建可于本地运行的、能够完成大部分基因组重测序数据基础计算的软件包。软件包首先将质控过滤后的重测序数据与参考基因组序列进行比对，利用比对结果检测基因组的遗传变异，对群体进行系统发育分析、群体结构分析、主成分分析、遗传多样性重要量化指标的计算和选择性消除分析等，并通过R或Python语言工具包对分析结果进行可视化。根据该软件包对来自3个群体、共约30尾大黄鱼个体的简化基因组测序数据进行分析测试的结果，完成了软件包携带的测序数据比对、单核苷酸多态性(SNP)鉴定、系统进化树构建、群体结构预测、连锁不平衡检测和多样性指标等计算功能，并且较好地图形可视化了分析结果。该群体基因组重测序分析的简易软件包可用于野生和自然群体的群体遗传学分析的大部分基础统计、计算和绘图，适合包括水生生物学在内的相关领域的生物学研究者进行群体基因组学研究。本研究为水生动物重测序数据分析提供便利，节约科研时间，减少人力物力成本。相关源码和使用说明文档已公开上传至...     

水生动物洄游分布研究方法综述

水生动物洄游分布是水生生物学研究的主要内容,目的是掌握水生动物洄游分布规律及其与水域环境之间的关系,以制定有效的资源保护和管理策略。标记技术监测、物种分布模型预测、生物体组织微量元素与稳定同位素分析推测是此类研究的主要方法,已被广泛应用于气候变化背景下水生动物洄游分布的研究。上述3种方法包括多种技术手段、模型以及分析测试内容,但现有研究报道缺乏对各种监测或预测方法的系统梳理,也鲜有各方法彼此之间的交叉或组合研究。本文从标记技术、物种分布模型、生物体组织微量元素与稳定同位素分析3个层面综述了水生动物洄游分布研究方法的特点及进展,同时,依据文献统计计量数据,明确了相关方法的实际应用情况。研究表明,3种方法是水生动物洄游分布研究的有效工具,现有研究注重每种方法内部之间的比较与改进,后续研究应加强3种方法彼此之间的交叉与组合研究。此外,对于渔业资源生物,渔获量统计分析法也可作为获得其洄游分布规律及适宜环境因子范围的研究方法。     

Early Development of the Mandarinfish, Synchiropus splendidus (Callionymidae), with notes on its Fishery and Potential for Culture

The mandarinfish, Synchiropus splendidus, is a small, pelagic-spawning enthic dragonet of the western Pacific. Although popular in the marine aquarium trade, little is known of its fishery or biology. All aquarium-trade animals are currently taken from the wild and the impact of heavy collecting is unknown. The specialized and selective nature of the fishery for mandarinfish is described and its potential to disrupt the mating system identified. As a possible alternative to wild capture and as an aid to sustainable exploitation, egg production and early development relevant to mariculture are described, including egg output, embryo, larva and post-settlement development to 30 days, based on live material. Egg output was determined for 40 females and ranged from 12 to 205 eggs. Embryo and larva development were rapid, with settlement occurring within 14 days at 24–26 °C, and at 3.5 mm TL. The swimbladder is retained in adults. Our limited attempts at raising the mandarinfish to settlement were encouraging and suggest an excellent potential for mariculture with implications for both conservation and improved maintenance of fish in captivity. At present, given that this species is difficult to maintain in captivity, it is only suitable for experienced aquarists. Preliminary diet information is provided. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

lncRNA在水产动物中的研究进展

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类全长超过200个核苷酸的RNA,其转录本缺少开放阅读框和保守密码子,无编码能力。lncRNA能够与RNA、DNA或蛋白质相互作用来介导靶基因的调控,可以在转录水平、转录后水平和表观遗传水平发挥作用。大量研究表明,lncRNA在生殖、胚胎发育、性别分化、免疫和代谢等方面起着关键作用。近年来,关于lncRNA在水产动物上的研究已取得一定成果,但是国内外尚缺乏对其进行全面总结的报道。鉴于此,本文主要对lncRNA的定义及分类、生物学特性、作用机制及在水产动物中的研究进展等方面进行综述,并对其在水产动物中的研究前景进行了展望,以期为以后深入开展lncRNA在水产动物上的功能研究提供参考。