Preparation and comparison of biological properties of recombinant carp (Cyprinus carpio) growth hormone and its Cys-123 to Ala mutant

Carp growth hormone (cGH) cDNA, in which Cys-123 was mutated to Ala, was prepared, transferred to the expression vector, expressed in Escherichia coli and the mutant was purified to homogeneity. The mutation only slightly improved yield of the monomeric fraction, indicating that Cys-123 is not involved in improper refolding. As compared to cGH, the mutant (cGH-C123A) exhibited lower binding affinity toward homologous liver receptors and lower bioactivity in a 3T3-F442A preadipocyte bioassay despite the fact that both hormones exhibited almost identical cross-reactivity with anti-cGH antibodies. These results, along with those of a structural comparison to hGH, suggest that Cys-123 is located in the hydrophobic core of the hormone, and is most likely affecting the conformation of the binding site. Dimeric forms of the hormone and its mutant were less active than their respective monomers. Homologous binding experiments using a carp liver microsomal fraction revealed a single receptor population with Kd = 0.77 nM and B_max = 241 fmol/mg microsomal protein.

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Résumé Un ADN complémentaire (cDNA) de l'hormone de croissance de carpe (cGH), dans lequel l'acide aminé Cys-123 a été muté en Ala, a été préparé, inséré dans un vecteur d'expression, et exprimé dans Escherichia coli. Le mutant a ensuite été purifié jusqu'à homogénéité. La mutation améliore seulement faiblement la production de la fraction monomérique, indiquant que le Cys-123 n'est pas impliqué dans un repliement erroné. Comparé à la cGH, sa forme mutée (cGH-C123A) montre une plus faible affinité de liaison vis à vis de récepteurs hépatiques homologues, et une plus faible activité biologique dans un test réalisé sur des préadipocytes 3T3-F442A; cela en dépit du fait que les deux hormones présentent des réactions croisées presque identiques avec un anticorps anti-cGH polyclonale. Ces résultats, associés à une comparaison à la structure de l'hGH, suggèrent que le Cys-123 est localisé dans la partie hydrophobique de l'hormone, et affecte, le plus vraisemblablement, la conformation du site de liaison. Les formes dimériques de l'hormone et de sa forme mutée sont moins actives que leurs monomères respectifs. Les études de liaison homologue, réalisées avec des fractions microsomales de foie, révèlent une population unique de récepteurs de Kd = 0,77 nM et de B_max = 241 fmol/mg de proteine microsomale.

     

Insulin-like growth factor I (IGF-I) mRNA expression in coho salmon,Oncorhynchus kisutch: Tissue distribution and effects of growth hormone/prolactin family proteins

To examine the hormonal and nutritional regulation of insulin-like growth factor I (IGF-I) mRNA expression, a sequence-specific solution hybridization/RNase protection assay for coho salmon IGF-I mRNA was developed. This assay is both rapid and sensitive and has low inter- (less than 15%) and intra-assay variations (less than 5%). Using this assay, the tissue distribution of IGF-I mRNA and effects of growth hormone (GH), prolactin (PRL) and somatolactin (SL) on hepatic IGF-I mRNA expression in coho salmon were examined in vivo. Liver had the highest IGF-I mRNA level of 16 pg/μg DNA. Significant amounts of IGF-I mRNA were also found in all other tissues examined (intestine 4.1, kidney 3.8, gill arch 2.4, brain 2.4, ovary 2.3, muscle 2.1, spleen 1.7 and fat 1.1 pg/μg DNA). Injection of coho salmon GH at doses of 0.1 and 1 μg/g body weight significantly increased the hepatic IGF-I mRNA levels in a dose-dependent manner. Injection of coho salmon SL, a recently discovered member of the GH/PRL family, stimulated the IGF-I mRNA expression at the higher dose (1 μg/g), whereas coho salmon PRL had no effect at either dose. Concentration-dependent stimulation by coho salmon GH was also obtained in vitro in primary culture of salmon hepatocytes in concentrations ranging from 0.01 to 1 μg/ml. These results indicate that IGF-I mRNA expression occurs in a variety of tissues in coho salmon, and that at least the hepatic expression is under the regulation of GH and possibly other hormones. The sequence-specific assay established in the present study can be used for accurate quantitation of IGF-I mRNA in salmonid species, and can contribute to a better understanding of the physiology of IGF-I in salmonids.

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Résumé Afin d'étudier les régulations homronales et nutritionnelles de l'expression des ARNm de l'IGF-I (insulin-like growth factor I), un dosage spécifique par hybridation en solution des ARNm d'IGF-I de saumon coho et protégé des RNases, a été développé. Ce dosage, à la fois rapide et sensible, présente un faible coefficient de variation inter- (< 15%) et intra- (< 5%) dosage. L'étude de la distribution tissulaire des ARNm de l'IGF-I et des effets de l'hormone de croissance (GH), de la prolactine (Prl) et de la somatolactine (SI) sur l'expression hépatique des ARNm de l'IGF-I, a été entreprise in vivo chez le saumon coho en utilisant ce dosage. Le foie présente les plus grandes quantités d'ARNm d'IGF-I (16 pg/μg d'ADN). Des quantités significatives d'ARNm d'IGF-I ont été également détectées dans tous les autres tissus étudiés (intestin 4,1; rein 3,8; branchie 2,4; ovaire 2,3; muscle 2,1; rate 1,7 et graisse 1,1 pg/μg d'ADN). L'injection à des saumons coho, de GH à des doses de 0,1 et 1 μg/g de poids vif, augmente significativement et de manière dose dépendante les niveaux hépatiques d'ARNm d'IGF-I. L'injection de SI de saumon coho, un membre récemment découvert de la famille GH/Prl, stimule avec la plus haute dose utilisée, l'expression des ARNm d'IGF-I alors que la Prl n'a aucun effet. La GH augmente de manière dose dépendante (0,01–1 μg/ml) l'expression in vitro des ARNm d'IGF-I par des ARNm d'IGF-I par des hépatocytes de saumon coho en culture. Ces résultats indiquent que, chez le saumon coho, l'expression des ARNm d'IGF-I est présente dans le nombreaux tissus et que, l'expression hépatique est, au moins en partie, régulée par la GH et peut-être par d'autres hormones. Le dosage par séquence spécifique mise au point dans le présent travail, peut-être utilisé pour la quantification précise des ARNm, d'IGF-I de salmonidés et devrait permettre une meilleure connaissance de la physiologie de L'IGF-I chez les salmonidés.

     

Ultrastructural characteristics of two distinct gonadotropes (GTH I- and GTH II-cells) in the pituitary of rainbow trout Oncorhynchus mykiss

The salmonid pituitary produces two chemically distinct gonadotropins (GTHI and GTHII). Ultrastructural characteristics of GTHI- and GTHII-producing cells were studied in the trout pituitary with electronmicroscopic immunocytochemistry using antisera against salmon GTHIβ- and IIβ-subunits. In pituitaries from vitellogenic fish, GTHI-cells were characterized by numerous dilated cisternae of the granular endoplasmic reticulum (GER) and a small number of Iβ-positive granules (diameter, 100–300 nm), whereas GTHIIβ-immunoreactivity was found on granules (diameter, 200–400 nm) and large globules (diameter, 500–4000 nm) in apparently different cells (GTHII-cells). Distinct cellular distributions of GTHI and GTHII were maintained during gametogenesis, although morphological characteristics of GTHI- and GTHII-cells overlapped each other due to changes in number and size of the granules, globules and cisternae of the GER. Interestingly, the globules in the GTHI-cells were immunonegative for GTHIβ, although in the GTHII-cells they were always stained with GTHIIβ-antiserum. These results confirm that GTHIβ and GTHIIβ are synthesized in distinctly different cell-types in the salmonid pituitary and indicate that morphological characteristics cannot be used to distinguish these two cell-types.

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Résumé L'hypophyse des salmonidés produit deux gonadotropines (GTHI et GTHII) chimiquement distinctes. Les caractéristiques ultrastructurales des cellules produisant la GTHI et la GTHII ont été étudiées par immunocytochimie en microscopie électronique en utilisant des anticorps dirigés contre les sousunités GTHIβ et GTHIIβ de saumon. Chez les poissons en vitellogenèse, les cellules à GTHI se caractèrisent par un réticulum endoplasmique granulaire (REG) contenant de nombreuses citernes dilatées et un petit nombre de granules positives à la GTHIβ (diamètre 100–300 nm) tandis qu'une immunoréactivité à la GTHII était trouvée sur des granules (diamètre 200–4000 nm) et de grands globules (diamètre 500–4000 nm) dans des cellules apparemment différentes (cellules à GTHII). Des distributions cellulaires distinctes de la GTHI et la GTHII se sont maintenues à des stades plus avancées de la gamétogenèse, bien que les caractéristiques morphologiques des cellules à GTHI et GTHII se recoupent suite à des changements dans le nombre et la taiile des granules, des globules et des citernes du REG. II est à remarquer que les globules prśents dans les cellules à GTHI étaient immunonégatifs à la GTHIβ alors que dans les cellules à GTHII ils étaient toujours marqués par l'anticorps contre la GTHIIβ. Ces résultats confirment que, dans l'hypophyse des salmonidés, les GTHIβ et GTHIIβ sont synthetisées dans des types cellulaires différents et indiquent que des caractéristiques morphologiques ne peuvent être utilisées pour distinguer ces deux types cellulaires.

     

Involvement of protein kinase C in the modulation of gonadotropin and growth hormone secretion from dispersed goldfish pituitary cells

It has been established that secretion of gonadotropin (GtH) and growth hormone (GH) release in goldfish are both stimulated by GtH-releasing hormone (GnRH); in addition GtH secretion is inhibited by dopamine D₂ mechanisms. In the present study, depletion of protein kinase C (PKC) in goldfish pituitary cells reduced the GtH and GH responses to GnRH and an activator of PKC in static culture. In perifusion studies, GtH released in response to sGnRH analog was greatly attenuated in PKC-depleted cells, however, hormone responses to forskolin were enhanced. Stimulation of dopamine D₂ receptors reduced the GtH, but not the GH, responses elicited by PKC activators. These results indicate that PKC participates in the GtH and GH responses to natural neuroendocrine regulators in the goldfish.

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Résumé Il a été établi que chez le poisson rouge, les sécrétions de gonadotropine (GtH) et d'hormone de croissance (GH) sont toutes les deux stimulées par la gonadolibérine (GnRH); de plus, la sécrétion de GtH est inhibée par des mécanismes dopaminergiques de type D₂. Dans le présent travail, la déplétion de la teneur en protéine kinase C (PKC) dans des cellules hypophysaires de poisson rouge réduit les résponses en GtH et GH au GnRH et à un activateur de la PKC de cellules maintenues en incubation statique. Dans des cellules maintenues en périfusion et soumises à une déplétion en PKC, la GtH libérée en réponse à un analogue du sGnRH est fortement diminuée, cependent les réponses hormonales à la forskoline sont augmentées. La stimulation des récepteurs dopaminergiques D₂ réduit, dans le cas d'action d'activateur de la PKC, la réponse en GtH mais pas en GH. Ces résultats indiquent que la PKC est impliquée dans les mécanismes de régulation de GtH et GH par des facteurs neuroendocriniens naturels.

     

Cloning and sequence analysis of hypothalamus cDNA encoding tilapia melanin-concentrating hormone

Melanin-concentrating hormone (MCH) is a neuroendocrine peptide involved in the regulation of skin pigmentation in teleosts. We isolated and sequenced a 543 bp hypothalamic cDNA encoding the MCH-preprohormone of tilapia (Oreochromis mossambicus). Initially, polymerase chain reaction (PCR) experiments were performed on hypothalamic RNA with a synthetic oligonucleotide primer corresponding to a conserved region of salmon and mammalian MCH peptide and an oligo dT primer. A 0.2 kb PCR fragment was obtained and found to have low but significant nucleotide sequence similarity with the 3′ ends of known MCH-mRNAs. Subsequently, the PCR fragment was used to screen λZAP cDNA libraries constructed from tilapia hypothalamic poly(A⁺) RNA. The cloned tilapia MCH preprohormone cDNA encodes a 133-amino acid protein of which 17 amino acids belong to the signal peptide. The MCH peptide sequence is located at the carboxy terminus of the preprohormone structure and is preceded by a pair of arginine residues which can serve as a proteolytic cleavage site. 23 to 25 amino acids further upstream in the prohormone structure three consecutive basic residues are present. Cleavage at this site would yield a 22-amino acid MCH gene-related peptide (Mgrp), which is much larger than (12− to 13-amino acid) salmon and mammalian Mgrp. A comparative structural analysis between tilapia preproMCH and its salmon and mammalian counterparts revealed that the MCH peptide sequence is very well conserved (100% identity with salmon and 75% identity with both rat and human MCH). In contrast, the remaining parts of the preproMCH structures have diverged considerably. Northern blot analysis revealed the presence of tilapia preproMCH mRNA in the hypothalamus and not in other brain regions nor in several peripheral tissues.

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Résumé La MCH (melanin-concentrating hormone) est un peptide neuroendocrinien impliqué dans la régulation de la pigmentation de la peau chez les Téléostéen. Nous avons isolé et séquencé un ADNC hypothalamique de 543 pairs de bases codant pour la préprohormone de la MCH de tilapia (Oreochromis mossambicus). Ce travail a débuté par des expériences de PCR (Polymerase Chain Reaction) qui ont été réalisées sur des ARNm hypothalamiques avec comme amorces un oligonucléotide synthétique correspondant à une région conservée du peptide MCH de saumon et de mammifère et un oligo dT. Un fragment de 0.2 kb a ainsi été obtenu par PCR et l'analyse de sa séquence nucléotidique montre une similitude faible mais significative avec les extrémités 3′ des ARNms de MCH connus. Ensuite ce fragment a été utilisé pour cribler des banques de cDNA construites dans λZAP à partir d'ARN poly (A⁺) d'hypothalamus de tilapia. L'ADNc de la préprohormone de MCH de tilapia code pour une proteine de 133 acides aminés dont 17 constituent le peptide signal. Le peptide de la MCH est localisé dans l'extrémité carboxy de la préprohormone et se trouve précédé par une pair de résidus arginine qui servent de site de coupure protéolitique. De plus, 3 résidus basiques consécutifs sont présents à 23–25 acides aminés en amont de la structure de la prohormone. La coupure à ce site permettrait d'obtenir un peptide associé au gène de la MCH (Mgrp) de 22 acides aminés, ce qui est beaucoup plus grand (de 12 à 13 acides aminés) que les Mgrp de saumon ou de mammifères. Une analyse structurale comparée entre la preproMCH de tilapia et la preproMCH de saumon et de mammifères montre que la séquence du peptide MCH est très conservée (100% d'identité avec le saumon et 75% d'identité avec la MCH humaine ou de rat). Par contre, les autres parties de la structure de la preproMCH ont divergé considérablement. L'analyse par “Northern Blot” met en évidence la présence d'ARNm de preproMCH dans l'hypothalamus de tilapia mais pas dans les autres régions du cerveau ni dans plusieurs tissus périphériques.

     

β-adrenergic signal transduction in fish: interactive effects of catecholamines and cortisol

The elevation of plasma catecholamine levels during acute stress initiates a series of compensatory physiological and biochemical mechanisms to alleviate the disruptive effects of stress on blood oxygen transport. Of particular importance is the β-adrenergic activation of a Na⁺/H⁺ antiporter associated with the red blood cell (rbc) membrane. Upon activation, the Na⁺/H⁺ antiporter extrudes H⁺ from the rbc and the resultant alkalinization of the rbc interior serves to enhance both the affinity and the capacity of haemoglobin O₂ binding. The activation of the Na⁺/H⁺ exchanger is dependent upon the intracellular accumulation of cyclic AMP. The extent of cyclic AMP accumulation is determined, in part, by the number and/or affinities of cell surface β-adrenoreceptors. Recent studies have shown that the number of cell surface β-adrenoreceptors are rapidly increased during acute hypoxia and that this phenomenon may explain the enhanced responsiveness of hypoxic rbc's to exogenous catecholamines. In certain instances, plasma catecholamine and cortisol levels rise concurrently. We recently have shown that chronic (10 day) elevation of cortisol levels, in vivo, or short-term (24h) elevation, in vitro, caused significant elevation of internalized β-adrenoreceptors. Upon exposure of the rbc's to hypoxia, these additional receptors are rapidly recruited to the cell surface where they become functionally coupled to adenylate cyclase. Ultimately, therefore, chronic elevation of plasma cortisol levels increases the responsiveness of the rbc to circulating catecholamines. We recently have identified similar enhancement of cell surface β-adrenoreceptors by cortisol and increased physiological responsiveness (glycogenolysis) to catecholamines in trout hepatocytes. Thus, chronic elevation of cortisol levels appears to be generally adaptive for increasing the sensitivity of the β-adrenergic signal transduction system of at least two cell types (rbc's, hepatocytes) involved in the amelioration of acute stress when plasma catecholamine levels rise.

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Résumé L'élévation des niveaux de cathécolamines plasmatiques pendant un stress aigu déclenche une série de mécanismes physiologiques et biochimiques de compensation destinés à suprimer les effets destructeurs du stress sur les transport d'oxygène par le sang. L'activation β-adrénergique de l'antipore Na⁺/H⁺ associé à la membrane des globules rouges du sang (rbc) est particulièrement importante. Après activation, l'antipore Na⁺/H⁺ excrète du globule rouge H⁺ et l'alcalinisation du milieu intérieur du globule qui en résulte sert à stimuler l'affinité et la capacité de liaison hémoglobine-O₂. L'activation de l'échangeur Na⁺/H⁺ est dépendante de l'accumulation intracellulaire d'AMP cyclique. La quantité d'AMP cyclique accumulée est déterminée en partie par le nombre et/ou l'affinité des β-adrénorécepteurs situés à la surface des cellules. Des études récentes montrent que le nombre de β-adrénorécepteurs de surface augmente rapidement pendant une hypoxie aigue et que ce phénomène pourrait expliquer la stimulation de la réponse des globules rouges hypoxiques à des cathécolamines exogènes. Dans certains cas, les niveaux plasmatiques de cortisol et de cathécolamine augmentent simultanément. Nous avons récemment montré qu'une augmentation chronique (10 jours) des niveaux de cortisol in vivo ou une élévation de courte durée (24h) in vitro conduisent à une augmentation des β-adrénorécepteurs internalisés. Suite à l'exposition de globules rouges à une hypoxie, ces nouveaux récepteurs sont rapidement recrutés à la surface de la cellule où ils deviennent fonctionnellement couplés à l'adénylate cyclase. En dernier lieu donc, une élévation chronique des niveaux de cortisol augmente la réponse des globules rouges aux cathécolamines circulants. Nous avons récemment identifié une augmentation similaire des β-adrénorécepteurs de surface cellulaire par le cortisol et une réponse physiologique (glycogénolyse) stimulée par les cathécolamines dans les hépatocytes de truite. Ainsi, une élévation chronique des niveaux de cortisol semble être en général adaptative et augmentant la sensibilité du système de transduction du signal β-adrénergique dans au moins 2 types de cellules (les globules rouges et les hépatocytes) impliquées dans l'amélioration du stress aigu quand les niveaux de cathécolamine plasmatique augmentent.

     

Osmoregulatory actions of growth hormone and its mode of action in salmonids: A review

Osmoregulatory actions of growth hormone (GH) and its mode of action in salmonids are reviewed. We present evidence suggesting that insulin-like growth factor I (IGF-I) mediates some of the actions of GH on seawater acclimation. Plasma concentration and turnover of GH rise following exposure to seawater. Exogenous GH (in vivo) increases gill Na⁺,K⁺-ATPase activity and the number of gill chloride cells, and inhibits an increase in plasma osmolarity and ions following transfer of fish to seawater. A single class of high affinity GH receptors is present in the liver, gill, intestine, and kidney. The levels of IGF-I mRNA in the liver, gill and kidney increased after GH-injection. After transfer to seawater, IGF-I mRNA increased in the gill and kidney following the rise in plasma GH, although no significant change was seen in the liver. Injection of IGF-I improved the ability of the fish to maintain plasma sodium levels after transfer to seawater. GH treatment also sensitizes the interrenal to adrenocorticotropin (ACTH), increasing cortisol secretion. Both cortisol and IGF-I may be involved in mediating the action of GH in seawater adaptation, although studies on the effect of GH on osmoregulatory physiology of non-salmonid species are limited. An integrated model of the osmoregulatory actions of GH is presented, and areas in need of research are outlined.

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Résumé Cet article est une revue des effets osmorégulateurs de l'hormone de croissance et de son mode d'action. Nous présentons des résultats qui suggèrent que le facteur de croissance de type insuline (IGF-I) est un médiateur de certaines des actions de la GH sur l'adaptation à l'eau de mer. Les concentrations plasmatiques et le renouvellement de la GH augmentent après transfert en eau de mer. La GH exogène stimule (in vivo) l'activité Na⁺,K⁺-ATPase et le nombre de cellules à chlorure branchialeset inhibe les augmentations de l'osmolarité et des concentrations ioniques du plasma observées après transfert en eau de mer. Une seule classe de récepteurs à haute affinité pour la GH est présent dans le foie, les branchies, l'intestin et le rein. Les niveaux d'ARNm d'IGF dans le foie, les branchies et le rein augmentent après injection de la GH. Après transfert en eau de mer, les ARNm de l'IGF augmentent dans les branchies et dans le rein en suivant l'augmentation de GH plasmatique, bien qu'aucune modification ne soit observée au niveau du foie. L'injection d'IGF augmente la capacité du poisson à maintenir ses niveaux de sodium plasmatique après transfert en eau de mer. Le traitement à la GH augmente la sensibilité à l'adrenocorticotropine (ACTH) et stimule donc les niveaux de cortisol. A la fois le cortisol et l'IGF-I semblent impliqués comme médiateurs des effets de la GH dans l'adaptation à l'eau de mer, bien que les études sur les effets de la GH sur la physiologie de l'osmorégulation chez les espèces non-salmonidés restent encore limitées. Un modèle intégré des actions de la GH sur l'osmorégulation est présenté et les domaines de recherche à développer sont soulignés.

     

Specific binding of [3H]17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one to oocyte cortices of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

Specific binding of [³H]17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17α,20β-DP) to plasma membranes prepared from defolliculated oocytes of rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) was identified and characterized. Binding was rapid and reached equilibrium in 30 min. 17α,20β-DP strongly inhibited [³H] 17α,20β-DP binding in a competitive manner. Scatchard analysis revealed two different binding sites: a high affinity binding site with a K_d of 18 nM and a B_max of 0.2 pmoles/mg protein; and a low affinity binding site with a K_d of 0.5 μM and a B_max of 1 pmoles/mg protein. This binding activity was successfully solubilized with n-heptyl-β-D-thioglucoside. [³H]17α,20β-DP binding to solubilized preparations reached equilibrium in 1h, and was competitively inhibited with 17α,20β-DP and 17α,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one. However, Scatchard analysis showed a single binding site with a K_d of 0.3 μM. The reason for the disappearance of the high affinity binding site in solubilized preparations remains unclear. These results demonstrate that a specific binding site for 17α,20β-DP exists in the plasma membrane of rainbow trout oocytes.

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Résumé Une liaison spécifique de le [³H]17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17α,20β-DP), avec des membranes plasmiques d'ovocytes défollicularisés de truite arc-en-ciel (Onchorhynchus mykiss), a été identifiée et caractérisée. Sa cinétique est rapide et atteint son équilibre en 30 minutes. Le 17α,20β-DP inhibe fortement, et de manière compétitive, la liaison de la [³H] 17α,20β-DP. Une étude de Scatchard a mis en évidence deux sites diffŕents de liaison: un site de forte affinité, de K_d 18 nM et de B_max 0,2 pmoles/mg de protéine; et un site de faible affinité, de K_d 0,5 μM et de B_max 1 pmoles/mg de protéine. L'activité de liaison a été solubilisée, avec succés, par le n-heptyl-β-D-thioglucoside. Dans la fraction soluble, la liaison de le [³H]17α,20β-DP atteint un équilibre en 1h.; et elle est complétement inhibiée par la 17α,20β-DP et le 17α,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one. Cependant, une étude de Scatchard ne permet de déceler qu'un seul site de liaison, de K_d 0,3 μM. La disparition du site de liaison de forte affinité dans la fraction soluble reste inexpliquée. Ces résultats démontrent l'existence d'un site spécifique de liaison du 17α,20β-DP dans les membranes plasmiques des ovocytes de truite arc-en-ciel.

     

Intracellular mechanisms mediating gonadotropin and growth hormone release in the goldfish,Carassius auratus

Evidence for the involvement of Ca²⁺, protein kinase C, cAMP, and arachidonic acid metabolism in mediating gonadotropin (GTH) and growth hormone (GH) release in the goldfish is reviewed. Models for the signal transduction pathways mediating GTH-releasing hormone (GnRH) and dopamine actions on GTH and GH secretion are postulated. A novel hypothesis that two GnRHs which bind to the same receptor type activate different transduction cascade in two different cell types (GTH vs. GH) as well as within the same cell type (GTH) is presented.

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Résumé Cette revue présente les données expérimentales démontrant l'implication de Ca⁺⁺, de la protéine kinase C et du métabolismes de l'acide arachidonique dans les mécanismes régulant la sécrétion des hormones gonadotrope (GTH) et de croissance (GH). Des modèles de signaux de transduction de l'action de la gonadolibérine (GnRH) et de la dopamine sur la sécrétion de GTH et de GH sont proposés. Les deux GnRHs existant chez le poisson rouge pourraient se lier au même type de récepteur et activer différentes voies de transduction dans deux différents types cellulaires (GTH vs. GH) ou dans un seul type (GTH).

     

The regulatory effects of thyrotropin-releasing hormone on growth hormone secretion from the pituitary of common carp in vitro

The effects of thyrotropin-releasing hormone (TRH) on growth hormone (GH) and gonadotropin (GtH) release, and the influences of somatostatin (SRIF), the dopamine agonist apomorphine (APO) and extracellular calcium on basal and TRH-induced GH release were examined using an in vitro perifusion system for pituitary fragments of common carp (Cyprinus carpio). Five minute pulses of different dosages of TRH stimulated a rapid and dose-dependent increase in GH release from the perifused pituitary fragments with an ED₅₀ of 9.7 ± 2.3 nM. TRH was ineffective on GtH release. SRIF significantly inhibited basal and TRH-induced GH release from the perifused pituitary fragments, and the effects of SRIF were dose-dependent. APO induced a dose-dependent increase in basal and TRH-stimulated GH release from the perifused pituitary fragments. Increasing the concentrations of extracellular calcium from 0 mM to 1.25 mM resulted in an increase in basal and TRH-induced GH release. The high dose of calcium (6.25 mM) caused a slight decrease in basal and TRH-induced GH release compared with those at a concentration of 1.25 mM.

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Résumé Les effets de la thyrotropine (TRH) sur la sécrétion d'hormone de croissance (GH) et de gonadotropine (GTH), et de la somatostatine (SRIF), de l'apomorphine (APO), antagoniste dopaminergique, et du calcium extracellulaire sur les sécrétions basale et stimulée de GH ont été étudiées in vitro par périfusion, de fragments d'hypophyses de carpe (Cyprinus carpio). Des applications de 5 minutes de TRH à différentes concentrations induisent une stimulation rapide et dose dépendante de la sécrétion de GH (ED₅₀ = 9.7 ± 2.3 nM). Le TRH est sans effet sur la sécrétion de GTH. Le SRIF inhibe la sécrétion basale de GH ainsi que la résponse hypophysaire à l'action du TRH. Son action est dose dépendante. L'apomorphine induit une augmentation dose dépendante de la sécrétion basale de GH et potentialise l'action du TRH sur la stimulation de la sécrétion de GH. Des effets équivalents sont induits par des concentrations croissantes de calcium extra cellulaire de 0 à 1.2 mM, alors qu'à une concentration de 6.25 mM des effets opposés sont obtenus.

     

Biochemistry and physiology of a family of eel natriuretic peptides

Three natriuretic peptides with similar structures were isolated from eels and their amino acid sequences determined; atrial natriuretic peptide (ANP) from atria, ventricular natriuretic peptide (VNP) from ventricles, and C-type natriuretic peptide (CNP) from brains. All three hormones were circulating in eel blood, and their plasma levels invariably decreased when eels were transferred from fresh water (FW) to seawater (SW). Eel ANP and VNP inhibited drinking in FW and SW eels. Eel ANP inhibited water and Na⁺ absorption by the intestine of SW eels. The potency of these ANP effects was 2–3 orders greater than those of other hormones which are known to have similar effects. Eel ANP and VNP induced antidiuresis but not antinatriuresis in FW eels. Eel ANP increased plasma cortisol level in SW eels but not in FW eels. The antidiuretic effect and the stimulation of cortisol secretion in eels are opposite to the ANP effects reported in mammals. These data suggest that ANP plays a complex role in the eel osmoregulation.

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Résumé Trois peptides natriurétiques présentant des structures similaires ont été isolés chez l'anguille et leurs séquences en acides aminés a été déterminées; le peptide atrial natriurétique (ANP) dans l'atria, le peptide ventriculaire natriurétique (VNP) dans les ventricules et le peptide natriurétique de type C dans le cerveau. Ces trois hormones sont présents dans le sang d'anguille et leur niveau plasmatique decroit invariablement quand les anguilles sont transférées d'eau douce en eau de mer. L'ANP et le VNP d'anguille inhibent l'action de boire chez les anguilles d'eau douce et d'eau de mer. L'ANP d'anguille inhibe l'absorption d'eau et de Na⁺ par l'intestin d'anguille en eau de mer. Ces effets de l'ANP sont 2 à 3 fois plus grands que ceux observés avec d'autres hormones qui sont connues pour avoir des effets similaires. L'ANP et le VNP d'anguille induisent l'antidiurèse mais pas l'antinatriurèse chez les anguilles d'eau douce. L'ANP d'anguille augmente chez ce poisson les niveaux de cortisol plasmatique en eau de mer mais pas en eau douce. L'effet antidiurétique et la stimulation de la sécrétion de cortisol chez l'anguille sont contraire aux effets de l'ANP observés chez les mammifères. Ces résultats suggèrent que l'ANP joue un role complexe dans l'osmorégulation de l'anguille.

     

GABA-ergic control of prolactin release in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) pituitaries in vitro

The involvement of γ-aminobutyric acid (GABA) in the control of prolactin (PRL) release was investigated in rainbow trout using both perifused pituitary fragments and pituitary cells in primary culture. In our perifusion system, infusion of GABA (10⁻⁶ to 10⁻⁴ M) caused an inhibition of PRL release (between 20 and 40%). Administration on perifused pituitary fragments of 3APS, a GABAa agonist, mimicked this inhibitory effect. Moreover, bicuculline, a specific antagonist of GABAa receptors, totally abolished GABA effect. When tested on cultured pituitary cells during 40h exposure, GABA (10⁻⁵ M) caused a significant decrease in PRL release (24.5%). Baclofen, a specific agonist for GABAb receptor tested at 10⁻⁶ and 10⁻⁵ M, also inhibited PRL released from cultured pituitary cells. These results demonstrate that GABA inhibits PRL release by acting directly on pituitary cells and that probably both types of GABA receptor (a and b) are involved in this regulation.

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Résumé Nous avons étudié l'implication de l'acide γ-aminobutirique (GABA) dans le controle de la sécrétion de prolactine (PRL) chez la truite arc-en-ciel en utilisant à la fois des fragments d'hypophyse perifusés et des cellules hypophysaires en culture. Dans notre système de périfusion, le GABA (10⁻⁶ à 10⁻⁴ M) inhibe la libération de PRL (entre 20 et 40%). L'administration sur les fragments d'hypophyse périfusés de 3APS, un agoniste des récepteurs GABAa, reproduit ces effets inhibiteurs. De plus, la bicuculline, un antagoniste spécifique des récepteurs de type GABAa, abolie complètement les effets du GABA. Lorsqu'il est testé pendant 40h sur des cellules en culture, le GABA (10⁻⁵ M) réduit de manière significative la libération de PRL (24.5%). Le Baclofen, un agoniste spécifique des récepteurs GABAb testé à 10⁻⁶ et 10⁻⁵ M, inhibe aussi la libération de PRL par les cellules en culture. Ces résultats démontrent que le GABA inhibe la libération de PRL en agissant directement sur les cellules hypophysaires et que les 2 types de récepteurs GABA (a et b) sont impliqués dans cette régulation.

     

Neuroimmunological regulation of α-MSH release in tilapia (Oreochromis mossambicus)

This study describes the effects of IL-1 (interleukin 1) and LPS (bacterial endotoxin lipopolysaccharide) on the release of α-MSH (alpha melanocyte stimulating hormone) from the neurointermediate lobe (NIL) of the teleost Oreochromis mossambicus (tilapia). In vivo treatment of tilapia with IL-1 for 8 days led to a 49% inhibition of basal α-MSH release, measured by means of an in vitro micro-superfusion technique. The treatment did not affect the sensitivity of the tissue to TRH. In vitro, the release of α-MSH was inhibited by LPS in a dose dependent manner. In addition to its effects on the unstimulated release of the hormone, LPS also blunted the response to a TRH stimulation. Together with recent results obtained by others demonstrating the effects of (neuro-)peptides on immune parameters and the presence of cytokines in fish, the present data establish the bidirectional character of the communication between the immune and the (neuro-)endocrine systems in teleosts.

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Résumé Cette étude décrit les effets de l'IL-1 (interleukin 1) et du LPS (bacterial endotoxin lipopolysaccharide) sur la libération de α-MSH (alpha melanocyte stimulating hormone) par le lobe neurointermédiaire (NIL) d'un téléosteen Oreochromis mossambicus (tilapia). Le traitement in vivo du tilapia avec l'IL-1 pendent 8 jours conduit à une inhibition de 49% de la libération basale d'α-MSH mesurée à l'aide d'une technique in vitro de micro-superfusion. Ce traitement ne modifie pas la sensibilité du tissue au TRH. In vitro, la libération de α-MSH est inhibée par le LPS de manière dose-dépendante. En plus de ses effets sur la libération basale de α-MSH, le LPS bloque aussi la réponse à une stimulation par le TRH. Confrontés à des donnés récemment publiés montrant les effets de (neuro-)peptides sur les paramêtres immunitaires et la présence de cytokines chez les poissons, nos résultats établissent le caractère bidirectionnel de la communication entre le système immunitaire et les systèmes (neuro-)endocriniens.

     

Androgen metabolism in the skin of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

Pieces of skin of male and female rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were incubated with testosterone and 11-ketotestosterone as substrates. In immature fish the conversion rate was low. In non-spawning adult males 11-ketotestosterone was reduced to 5α-11KDHT (up to 5.2%). In the fish in spawning condition the 5α-reduction rate was only about 1 to 2%. In the same specimens incubated with testosterone a high 11β-hydroxylase activity (23.8-25% in the male and 13% in the female skin) was found. Similar sex specific differences were observed for the occurence of 5α-reduced metabolites (about 20% in the male and 13% in the female tissue).

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Résumé Des fragments de peau de truites arc en ciel (Oncorhynchus mykiss, males ou femelles, ont été incubés avec de la testostérone ou de la 11-cétotestostérone, utilisées comme substrats. Chez les poissons immatures, les taux de conversion restent faibles. Chez les males adultes ne donnant pas de sperme, la 11-cétotestostérone est réduite en 5α-androstane-17β-ol-3,11-dione (jusqu'à 5.2%). Chezles poissons en conditions de fraie, le taux de 5α-réduction est seulement de l'ordre de 1 à 2%. Pour ce derniers individus, les incubations de peau en présence de testostérone montrent l'existence d'une forte activité 11β-hydroxylase (23.8-25% pour le male, et 13% pour la femelle). Des différences liées au sexe sont observées de la même manière dans la production de métabolites 5α-réduits (environ 20% avec le tissu male et 13% avect le tissu femelle).

     

Catecholamine synthesis in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) brain: modulation of tyrosine hydroxylase activity

Levels of catecholamines and tyrosine hydroxylase (TH) activity were measured in brain homogenates from female rainbow trout. In triploid fish or in diploid fish in ovarian recrudescence, the patterns of catecholamine content expressed as a function of in vitro TH activity vary in different areas of the brain. K_m for the pterin cofactor is lower in the telencephalon than in the hypothalamus. Dopamine (DA) and 2-hydroxyestradiol (20HE₂) inhibit TH activity (by competitive and non-competitive interaction respectively). The K₁ for DA were different in the telencephalon and the hypothalamus and this could explain the different patterns of catecholamine levels and TH activity for these two structures. 20HE₂ inhibits TH activity in vitro; a catechol moiety is required since estradiol (E₂) is notinhibitory. However, the exact mechanism of inhibition remains unclear. The rapid effect of 20HE₂ cannot explain the previously reported activation of catecholamine synthesis by E₂ in vivo.

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Reśumé Les taux de catécholamines cérébrales et l'activité in vitro de la tyrosine hydroxylase (TH) ont été déterminés chez la truite arc en ciel femelle. Chez des animaux triploides ou diploides en recrudescence ovarienne, les taux de catécholamines sont corrélés différemment à l'activité TH selon la structure cérébrale considérée. Le télencéphale présente un K_m apparent pour la ptérine plus faible que l'hypothalamus. La dopamine (DA) et le 2-hydroxyestradiol (20HE₂) inhibent l'activité de la TH selon des mécanismes respectivement compétitifs Les différents K₁ pour la DA obtenus au niveau du télencéphale et de l'hypothalamus pourraient expliquer les différentes relations entre taux de catécholamines et activité TH obtenues pour ces deux structures. Le 20HE₂ inhibe également l'activité TH in vitro: la présence d'un radical catéchol s'avère nécessaire (l'oestradiol (E₂) n'est pas actif par lui-même), mais le mécanisme de l'inhibition reste à déterminer. Les effets rapides du 20HE₂ ne peuvent expliquer l'activation de la synthèse catécholaminergique par l'E₂ in vivo démontrée antérieurement.

     

Some whys and wherefores in fish endocrinology?

Summary Endocrinology has considerably expanded its field in recent years and many mechanisms of regulation in biology involve hormone related factors (biochemical mediators) which can be found in all living organisms. Endocrinology has provided powerful tools to understanding the regulation of many functions in fish and other animals. The various models seen in the composite group of fish permit fruitful comparisons with those in other groups of vertebrates and allow these to be placed into an evolutionary perspective. Applications to medical sciences have been derived from work originally carried on in fish endocrinology and several concepts developed on mammals and higher vertebrates were useful for research on fish. Endocrinology has had a major impact on the knowledge of many aspects of fish biology, such as reproduction, osmoregulation, stress, growth, and pathology, with application to fish farming. It has provided conceptual and technical tools for the control of several functions of some cultivated species and has contributed to the efficient domestication of several fish species.

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Résumé Récemment, le domaine de l'endocrinologie s'est considérablement étendu et de nombreux mécanismes de régulation biologique impliquent l'intervention d'hormones et de facteurs apparentés (médiateurs biochimiques) qui se rencontrent dans tous les organismes vivants. L'endocrinologie apporte des outils puissants pour comprendre la régulation de nombreuses fonctions chez les poissons ausens large comme chez les autres animaux. Les modèles variés rencontrés chez les poissons permettent des comparaisons fructueuses avec d'autres groupes de vertébrés et de les replacer dans un contexte evolutif. Les sciences médicales ont bénéficié de recherches conduites chez les poissons et divers concepts développés chez les mammifères et vertebrés supérieurs se sont révélés utiles pour le développement de travaux sur les poissons. L'endocrinologie a largement contribué au développement des connaissances de base sur la biologie des poissons dans des domaines comme la reproduction, l'osmorégulation, la croissance, le stress et l'adaptation ainsi que la pathologie avec des applications à la pisciculture; elle a apporté des outils conceptuels et techniques pour le contr?le de quelques fonctions chez les espèces d'élevage et a efficacement contribué à la domestication de quelques espèces de poisson.

     

Effect of restricted access to demand-feeders on diurnal pattern of liver composition,plasma metabolites and hormone levels in Oncorhynchus mykiss

In order to study the relative importance of the feeding time and the light/dark alternation, as synchronizers of metabolic and endocrine parameters, the hepatosomatic index, liver glycogen contents, plasma glucose, nonesterified fatty acids, cortisol, growth hormone and thyroid hormone concentrations between dawn −2h and dawn + 12h are described in immature rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Trout were held in groups of 30 individuals and given access to a demand-feeder for only 3h per day, between dawn and dawn + 3h for 6 aquaria, and between dawn + 4h and dawn + 7h for another series of 6 aquaria. There was a clear effect of the time of food access on most of the studied parameters, with a decreased amplitude of variation, or a decreased mean level, in the fish eating in the middle of the photophase, compared with the fish eating at dawn. Superimposed on this apparent depressive effect of phase shifting of food access, some parameters also show direct responses to the shift of eating time, with a post-prandial increase or decrease.

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Résumé Afin d'étudier l'importance relative de l'heure des repas et de l'alternance jour/nuit, en tant que synchroniseurs de paramètres métaboliques et endocriniens ches des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) immatures, 6 lots de 30 individus, avaient accès à un distributeur d'aliments à la demande durant les 3 premières heures du jour (8h–11h), tandis que 6 autres lots de 30 individus n'avaient accès aux distributeurs d'aliments qu'au milieu de la photophase (12h–15h). Durant les 8 derniers jours, l'indice hépatosomatique, le taux de glycogène hépatique, ainsi que les concentrations plasmatiques en glucose, acides gras non-estèrifiès, cortisol, GH et hormones thyroidiennes ont été suivis entre l'aube 2h et l'aube + 12h. Il a alors été observé un effet significatif de l'heure d'accès à la nourriture sur la plupart des paramètres étudiés, se traduisant par une diminution de l'amplitude de variation de ces paramètres, ou encore une diminution de leurs valeurs moyennes, chez les truites ayant accès à la nourriture au milieu de la période d'éclairement par rapport à celles ayant accès aux distributeurs d'aliments à l'aube. Pour certains paramètres, il a aussi été observé une réponse plus directe, avec un changement post-prandrial des valeurs enregistrées, superposé à cet apparent effet dépresseur du décalage de la phase d'alimentation.

     

Arginine vasotocin and fish osmoregulation

Pituitary arginine vasotocin (AVT) secretion is sensitive to the osmotic challenge associated with transfer of euryhaline teleosts between sea water (SW) and fresh water (FW). Pituitary AVT content in FW-adapted flounders greatly exceeds that in SW-adapted fish. Plasma AVT concentrations are in the range 10⁻¹²−10⁻¹¹ M (1–100 pg/ml). In euryhaline species, like the eel, flounder and trout, there were no consistent, marked differences in plasma AVT concentrations between FW- and SW-adapted fish. In SW- but not FW-adapted flounders plasma AVT and sodium concentrations are correlated. During the initial period of acclimation from FW to SW eels, show a transitory rise in plasma AVT concentration which is associated with a transitory increase in plasma Angiotensin II. In view of the range of plasma AVT concentration observed in SW- and FW-adapted fish, it is evident that of the described dose-dependent effects of AVT on urine production, only the antidiuretic responses are likely to be of physiological significance. In addition to the presence of a V₁-type vascular receptor for AVT, the nephron also possesses a V₂-type receptor, coupled to adenylate cyclase. In the gill tissue AVT receptors are also present, but in this tissue receptor occupancy leads to inhibition of cAMP production rather than the stimulation observed in renal tissue. The functional significance of the gill AVT receptor remains to be established.

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Résumé La sécrétion d'arginine vasotocine (AVT) hypophysaire est sensible aux modifications de la pression osmotique observées lors du transfert d'eau douce en eau de mer de téléostéens euryhalins. Les contenus hypophysaires en AVT chez des flets adaptés à l'eau douce sont largement supérieurs à ceux des poissons adaptés à l'eau de mer. Les concentrations plasmatiques en AVT se situent entre 10⁻¹² et 10⁻¹¹ M. Chez les espèces euryhalines comme l'anguille, le flet et la truite, iln'y a pas de différences marquées dans les concentrations plasmatiques d'AVT en eau douce et en eau de mer. Chez des poissons adaptés à l'eau de mer, les niveaux plasmatiques d'AVT et de sodium sont corrélés ce qui n'est pas le cas chez les poissons adaptés à l'eau douce. Pendant la période initiale d'aclimatation à l'eau de mer, une augmentation transitoire des niveaux plasmatiques d'AVT est observée chez l'anguille, associée à une augmentation de l'angiotensine II plasmatique. Compte tenues des concentrations plasmatiques d'AVT mesurées chez des poissons adaptés à l'eau douce ou à l'eau de mer, il est evident que parmi les effets dose-dépendants de l'AVT sur la production d'urine décrits dans la littérature, seules les réponses antidiurétiques ont vraissemblablement une signification physiologique. En plus de la présence de récepteurs vasculaires pour l'AVT de type V₁, le nephron possède aussi des récepteurs de type V₂ couplés à l'adénylate cyclase. Dans les branchies, les récepteurs à l'AVT sont aussi présents, mais dans ce tissu, l'occupation des récepteurs conduit à une inhibition de la production d'AMPc contrairement à la stimulation observée dans le tissu rénal. La signification fonctionnelle du récepteur branchial à l'AVT reste à établir.

     

Branchial calcium uptake: possible mechanisms of control by stanniocalcin

The branchial Ca²⁺ uptake by teleost fish is under inhibitory control by the hormone stanniocalcin (STC) which is generated by the corpuscles of Stannius (CS). Removal of the CS in North American eel, Anguilla rostrata LeSueur, induced a rapid rise in blood calcium levels. Branchial Ca²⁺ influx following the extirpation of the CS (stanniectomy, STX) increased during the first four days and stayed elevated thereafter (in agreement with previous studies). The transepithelial potential (TEP) across the gills did not change after STX and this means that the electrochemical gradient for Ca²⁺ is less favourable for passive influx of Ca²⁺ in STX eel. Therefore, the Ca²⁺ influx in STX eels is a transcellular flux, with Ca²⁺ crossing the apical and basolateral membrane barrier. The kinetics of ATP-driven Ca²⁺-transport across basolateral plasma membranes from eel gills did not change after STX. Thus, the increased Ca²⁺-influx after STX is not correlated with changes in ATP-dependent Ca²⁺-extrusion across the basolateral membrane, suggesting a regulation at the apical membrane. Moreover, STC did not affect ATP-driven Ca²⁺-transport in isolated basolateral membranes (in vitro). STC (0.1 nM) reduced cAMP levels in dispersed eel gill cells. It had no significant effect on the IP₃ levels in these cells. We postulate that STC controls the permeability to Ca²⁺ of the apical membranes of the Ca²⁺ transporting cells of fish gills by controlling second messenger operated Ca²⁺ channels in the apical membrane.

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Résumé L'entrée de calcium au niveau des branchies est sous le controle inhibiteur de la stanniocalcine (STC) qui est synthétisée au niveau des corpuscules de Stannius (CS). L'ablation des CS chez l'anguille d'Amérique du Nord, Anguilla rostrata LeSueur, induit une augmentation rapide des niveaux de calcium dans le sang. Le flux entrant branchial de calcium consécutif à l'ablation des CS (stanniectomie, STX) augmente pendant les 4 premiers jours et reste élevé au-delà (en accord avec des études antérieures). Le potentiel transépithélial (TEP) à travers les branchies ne change pas après STX, ceci indiquant que le gradient électrochimique du Ca²⁺ est moins favorable pour le flux entrant passif du Ca²⁺ chez l'anguille STX. En conséquence, le flux entrant de Ca²⁺ chez l'anguille STX est un flux transcellulaire, avec le Ca²⁺ traversant la barrière membranaire apicale et basolatérale. La cinétique du transport de Ca²⁺ conduit par l'ATP à travers les membranes plasmatiques basolatérales de branches d'anguille n'est pas modifiée après STX. Ainsi, l'augmentation du flux entrant de Ca²⁺ après STX n'est pas corrlée avec des modifications de l'excrétion de Ca²⁺ conduit par l'ATP à travers la membrane basolatérale, suggérant donc une régulation au niveau de la membrane apicale. De plus, la STC ne modifie pas le transport de Ca²⁺ conduit par l'ATP dans des membranes basolatérales isolées (in vitro). La STC (0.1 nM) réduit les niveaux d'AMPc dans des cellules dispersées de branchies d'anguille. Cette hormone n'a pas d'effet significatif sur les niveaux d'IP₃ dans ces cellules. Nous suggérons que la STC régule la perméabilité au Ca²⁺ des membranes apicales des cellules branchiales transporteuses de Ca²⁺ en controlant un second messager agissant sur les canaux calciques de la membrane apicale.