MHC基因的遗传变异及其与鱼类抗病性研究进展

概述了主要组织相容性复合体（MHC）的结构与功能以及在脊椎动物特别是鱼类中的研究进展。对MHC基因的遗传变异与鱼类抗病性机制做了较为详细的阐述,介绍了MHC的遗传变异与多种鱼类抗病性关系的研究进展,重点介绍了草鱼MHC基因的研究。展望了MHC基因在鱼类及草鱼未来抗病育种中的研究前景。     

鱼类MHC及其基因研究进展

MHC广泛存在于脊椎动物中,在鱼类中由于其高度的多态性,使其在遗传进化、免疫相关、抗病育种等方面倍受关注.本文综述了国内外关于鱼类MHC基因的遗传结构、功能特性及系统学方面的研究进展,并展望了将此类基因应用于遗传育种中的前景,以及制约研究所存在的问题.     

MHC基因在鱼类遗传育种中的研究与应用

主要组织相容性复合体（MHC,Major histoeompatibility complex）是最具多态性的免疫分子。其多态性主要取决于群体内MHC基因的大量等位基因及等位基因间高度的序列变异。等位基因的序列变异主要发生在抗原肽结合区（peptide binding region,PBR）,这决定了不同基因型个体的免疫力差异。鱼类受多倍化影响,MHC基因的多态性还表现在同一基因存在多个基因座位（多拷贝）。MHC的高度多态性及与机体免疫力的相关性,使其在鱼类遗传进化、抗病育种等方面倍受关注。本文介绍了有关鱼类MHC基因的结构、功能及其在遗传育种中的应用。     

鱼类主要组织相容性Ⅱ类基因的研究进展

简要概述了鱼类主要组织相容性复合体(MHC)的遗传图谱及起源,对鱼类的MHCⅡ类基因的结构、抗原分子组成、表达及功能、遗传多态与进化机制作了较为详细的阐述。建议鱼类主要组织相容性复合体Ⅱ类基因座、等位基因组、等位基因及单倍型的命名规则尚需进一步规范,并提出有关鱼类MHCⅡ类基因的研究在抗病育种以及鱼类分子系统学上的重要意义     

鱼类MHCⅡ类基因与免疫抗性的研究进展

主要组织相容性复合体（MHC）与免疫应答和疾病抗性密切相关，对其免疫遗传机制的深入探讨是多年来的研究热点。随着分子生物学的发展，从遗传选育角度提高鱼对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的功效。本文就鱼类MHCⅡ类基因的表达调控和多态性研究，与细菌性疾病、病毒性疾病和寄生虫的关联分析加以阐述，为今后进一步探讨MHC基因与鱼类抗病育种等提供了参考。     

草鱼SREBP-1基因的克隆及糖对其在肝脏中表达的影响

固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控糖脂代谢相关基因表达的关键核转录因子。为获知草鱼SREBP-1基因的序列及其在肝脏中的表达规律,本实验采用同源克隆和RACE方法获得了草鱼SREBP-1基因的部分cDNA序列,并通过生物信息学方法对该基因及所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术,对SREBP-1基因在8种不同组织的表达规律及低糖(糖含量24%)和高糖(糖含量42%)投喂条件下肝脏中的表达水平进行了研究。结果显示,所克隆到的草鱼SREBP-1基因cDNA长4 760 bp,其中包括开放读码框3 426bp,编码1 141个氨基酸;草鱼SREBP-1具有一个典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构(bHLH-zip);氨基酸序列比对结果显示,草鱼SREBP-1与其他鱼类的同源性在76%~88%之间,与斑马鱼的进化关系最近;草鱼SREBP-1基因在脑中的表达量最高,肝脏和肠次之,在肾脏、脾脏、肌肉、脂肪和性腺中均有少量表达;与对照组相比,SREBP-1基因在高糖诱导下表达量显著提高(P0.05),低糖诱导下没有显著性差异。研究表明,在高糖负荷条件下,草鱼肝脏中SREBP-1可能会促进糖的利用和转化,从而参与糖代谢调节过程,为丰富鱼类糖代谢调控机理提供研究资料,并有望为提高鱼类对饲料糖的利用效率提供理论依据。     

高盐胁迫下大弹涂鱼MHC Iα基因对病毒拟似物poly(I:C)的免疫反应

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一类编码细胞表面糖蛋白的基因,在所有硬骨鱼的适应性免疫系统中起着至关重要的作用,而关于MHC基因的研究一直是鱼类分子免疫学和鱼类抗病辅助育种的研究热点之一。本研究首次分析了大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)MHCIα基因的cDNA序列特征,构建了系统发生树,评估了大弹涂鱼MHC Iα基因mRNA在健康个体不同组织中的表达差异,研究了注射病毒拟似物poly(I:C)后MHC Iα基因在机体主要免疫器官肝和脾的表达情况。结果显示,大弹涂鱼MHC Iα基因具有由1101个碱基组成的开放阅读框(ORF),共编码366个氨基酸残基,具有3个蛋白激酶C-磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和1个N-糖基化位点。系统发育分析显示与大弹涂鱼MHCIα基因亲缘关系最密切的是河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)。RT-PCR分析显示,MHCIα基因mRNA在不同组织中均有表达,其中肾和脾组织中表达量最高,鳃和肠组织中表达次之。大弹涂鱼在腹腔注射poly(I:C)后,肝和脾组织中mRNA表达量明显上升,在12 h时, MHC Iα基因mRNA表达量在肝和脾中均达到峰值。本研究结果表明, MHC Iα基因参与了大弹涂鱼在高盐胁迫下的免疫应答。     

鱼类同工酶应用及研究进展

阐述了鱼类同工酶研究进展,囊括同工酶在鱼类分类、发育遗传学、系统发育、生化遗传变异、多倍体研究及其组织特异性等方面的应用,并提出现存问题及发展方向。     

草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列克隆与分析

应用PCR和Genome Walking技术克隆获得长度为168 bp的草鱼（ Ctenopharyngodon idellus）α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列和2063 bp的5＇侧翼序列。将草鱼α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列与已知几种鱼类α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列比对,相似度为68%~86%。将草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列进行生物信息学分析,确定了其转录起始区域及转录起始位点（ TSS）;在TSS上游30 bp处有1个TATA-box,-58 bp处有CCAAT-box;在5＇侧翼序列中还发现有GATA-1、OCT-1、GR、HNF-3、AP1和SP1等转录因子结合位点。草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列的克隆,为进一步研究不同食性鱼类α-淀粉酶基因侧翼序列的差异、鱼类α-淀粉酶基因的表达、功能及调控机理奠定基础。     

3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异

为研究处于同一时期但养殖条件不同的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼体规格与发育状态间是否具有一致性,观察压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏的显微结构,并对压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼进行腹腔注射疫苗处理,实时荧光定量PCR检测免疫7 d后、14 d后各期草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM与MHCⅠ的表达量。结果显示,压塘3月龄草鱼各组织发育较普通3月龄草鱼迟缓。压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼在免疫后,头肾、中肾、肠道与脾脏中IgM和MHCⅠ的表达量均有上升,且IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍;MHCⅠ为56.02倍。结果表明,草鱼出血病活疫苗可以增强草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM和MHCⅠ的表达,且在3月龄时期进行注射免疫效果最佳。     

Association of a specific major histocompatibility complex class IIβ single nucleotide polymorphism with resistance to lactococcosis in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss (Walbaum)

Major histocompatibility complex (MHC) loci encode glycoproteins that bind to foreign peptides and initiate immune responses through their interaction with T cells. MHC class II molecules are heterodimers consisting of α and β chains encoded by extremely variable genes; variation in exon 2 is responsible for the majority of observed polymorphisms, mostly concentrated in the codons specifying the peptide‐binding region. Lactococcus garvieae is the causative agent of lactococcosis, a warm‐water bacterial infection pathogenic for cultured freshwater and marine fish. It causes considerable economic losses, limiting the profitability and development of fish industries in general and the intensive production of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), in particular. The disease is currently controlled with vaccines and antibiotics; however, vaccines have short‐term efficacy, and increasing concerns regarding antibiotic residues have called for alternative strategies. To explore the involvement of the MHC class II β‐1 domain as a candidate gene for resistance to lactococcosis, we exposed 400 rainbow trout to naturally contaminated water. One single nucleotide polymorphism (SNP) and one haplotype were associated with resistance (P < 0.01). These results are promising for using MHC class IIβ as a molecular marker in breeding rainbow trout resistant to lactococcosis.     

用电融合结合继代移核方法构建草鱼抗病体细胞工程鱼

选择对草鱼出血病病毒不敏感的草鱼肝细胞进行细胞培养，建立了草鱼肝细胞株，命名为ＧＬＡ。对ＧＬＡ进行攻毒，发现其对ＦＲＶ有抗性。采用电融合结合继代移核的方法，将ＧＬＡ细胞，移植于草鱼未受精卵内，获得开口前的幼鱼８尾和存活仔鱼１尾，说明此方法能提高细胞的发育功能。     

饲料中添加谷胱甘肽对草鱼生长、生理指标和抗病力的影响

选用初始体质量约8.50 g的草鱼(Ctenopharyngodon idella),在56 d的饲养期中分别投喂添加5种不同剂量谷胱甘肽(GSH)(添加量分别为0 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg和400 mg/kg)的试验饲料,观察GSH对草鱼生长、生理指标和抗病力的影响。结果表明,饲料中添加GSH能够提高草鱼特定生长率、存活率和饲料效率。其中,300 mg/kg GSH组草鱼的特定生长率和400 mg/kg GSH组草鱼的存活率显著高于对照组;添加GSH各组草鱼的饲料效率均显著高于对照组,当添加量为200 mg/kg时草鱼饲料效率达到最高。与对照组相比,饲料中添加GSH的各组草鱼肝胰指数明显升高,其中200 mg/kg组达到显著水平。饲料中添加GSH能够提高血清IGF-1水平,其中300 mg/kg和400 mg/kg组显著高于对照组。与对照组相比,各实验组草鱼血液白细胞数目有不同程度升高,其中300 mg/kg和400 mg/kg组均达到显著水平。饲料中添加GSH可以提高草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗能力,其中200 mg/kg GSH组草鱼攻毒后存活率达到最高。以特定生长率为判定指标,GSH在草鱼饲料中的适宜添加量为350 mg/kg。     

草鱼肠道微生物抗生素抗性基因研究

水产养殖过程中抗生素的过度使用导致耐药菌株不断出现，细菌耐药性成了威胁公共安全的一个全球性问题。抗性基因是细菌产生耐药性的根本原因，动物肠道微生物是抗性基因的储存库，然而目前我国对水产养殖动物消化道微生物抗生素抗性基因的研究匮乏。为探究草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肠道微生物中抗性基因的类型和丰度，通过提取草鱼肠道内容物的基因组DNA，采用shotgun宏基因组技术进行测序和序列注释，分析草鱼肠道内容物微生物数据，对比抗性基因数据库ARDB筛选出微生物序列中的抗性基因。结果表明，草鱼肠道内容物共有61554个可注释微生物的基因序列，包括409个真核生物序列、88个古细菌序列和61057个真细菌序列；共得到1011个抗性基因，归为123种基因型，包括78种单抗性基因型（679个单抗性基因），45种多抗性基因型（304个多抗性基因），多抗性基因数量占抗性基因总数的30.1%，说明草鱼肠道中可能存在大量的多重耐药性微生物；检出草鱼肠道中数量最多的抗性基因是抗大环内酯类抗生素基因MacB，其在国内水环境中研究甚少，可能是因为其单独存在时无法使微生物表现出抗性。本研究统计了草鱼肠道中微生物抗生素抗性基因的种类及数量，为水产养殖中抗生素的使用监管提供基础数据，验证了宏基因组测序技术检测抗性基因的可行性。     

Immune genes of the Atlantic salmon, Salmo salar L.: application of modern molecular genetic techniques to the study of antibodies and major histocompatibility complex antigens

Abstract. Molecular cloning methods and strategies which have been employed to reveal the exact nature of antibodies (immunoglobulins) and major histocompatibility complex (MHC) antigens from Atlantic salmon, Salmo salar L., have been discussed briefly. As in other fish species, the immunoglobulin heavy chain (IgH) of the Atlantic salmon has the typical characteristics of the IgM heavy chain from higher vertebrates. The membrane form of IgH is somewhat special, as the mRNA splicing pattern excludes the fourth constant exon, generating a membrane-anchored IgM one domain shorter than the mammalian counterparts. This splicing pattern has also been reported from cod and catfish, and seems to be general for teleosts. Notably, Atlantic salmon possess two isotypic IgM heavy chain constant region genes. The presence of two closely related IgH genes is in accordance with the quasi-tetraploid state of the Atlantic salmon genome, which means that the entire gene complex is probably duplicated. As deduced from phylogenetically conserved amino acid residues and the pattern of polymorphic residues, MHC antigens from Atlantic salmon seem to parallel those from higher vertebrates. Improvement of disease resistance in aquaculture stocks is discussed in relation to MHC polymorphism.     

甲壳素发酵液养殖草鱼、鲢鱼幼鱼试验

为研究甲壳素发酵液对草鱼和鲢鱼幼鱼养殖效果,用商品壳聚糖作参比,基础饲料为对照组,分析甲壳素发酵液对鱼体生长和水质环境等影响。试验结果表明,甲壳素发酵液处理组草鱼和鲢鱼幼鱼质量相对增长率比对照组高36.25%和122.47%(P0.05),草鱼体内脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶3种消化酶分别比对照组高144.39%、29.53%和29.75%,鲢鱼体内消化酶比对照组高48.06%以上(P0.05)。与对照组比较,甲壳素发酵液显著降低水中亚硝态氮(61.84%)、氨态氮(30.06%)、总磷含量(52.43%),提高了草鱼对嗜水气单胞菌抗性。在试验条件下,甲壳素发酵液对草鱼和鲢鱼幼鱼起到一定的促生长作用,并能改善水质环境,甲壳素发酵液具有作为微生态制剂开发应用的潜力。     

致死方式对养殖草鱼肉挥发性成分的影响

采用电子鼻技术和固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术研究了抽血和急杀致死草鱼肉挥发性成分的差异。通过电子鼻检测分析,抽血致死对草鱼背肉和腹肉的挥发性成分有影响,对红肉部分无影响或影响不大;固相微萃取技术可以有效地吸附草鱼肉中的挥发性成分,经NIST质谱数据库检索和文献对照,抽血致死草鱼背肉、腹肉和红肉分别确定出27、29和47种挥发性成分,急杀致死草鱼背肉、腹肉和红肉分别确定42、41和43种挥发性成分,可见致死方式对草鱼背肉和腹肉的挥发性成分影响较大,相对来说对红肉的影响较小;鱼血中确定46种挥发性成分,其中34种为芳香族化合物,相对含量达75.59%。因此,建议草鱼加工或食用前采用抽血致死方式。     

草鱼病毒性出血病研究进展

草鱼出血病是严重困扰着草鱼养殖业发展的一大疾病。根据近几十年来对于该病研究的进展,就草鱼出血病病原的生物学特性、不同发现株之间的比较、分子生物学研究以及疾病的防治等方面进行综合评述,总结了草鱼出血病的研究现状及研究中亟待解决的问题,并提出了该领域以后的重点研究方向。为进一步深入开展对该病的防治研究提供参考,以提高草鱼养殖的生产率。