枸杞岛铜藻气囊形态特征及其与环境因子的关系

为更好地分析东海海域漂流铜藻是源于舟山海域底栖铜藻的可能性,并为此提供实地生态学参考依据,本研究以枸杞岛海域底栖铜藻为对象,研究底栖铜藻植株和气囊的形态特征变化及其对海洋环境因子变化的响应,探讨底栖铜藻气囊发育成熟的窗口期。结果显示,9月铜藻植株顶部的主侧枝开始出现气囊,翌年3—5月铜藻藻体生长速率最大,3—4月主侧枝的气囊数量快速增长,4月每根主侧枝平均气囊数量达最大,气囊发育成熟。各月气囊的数量、平均长度和平均湿重的分布为顶部主侧枝中部主侧枝底部主侧枝,平均直径较均匀,底部主侧枝气囊平均体积显著小于顶部和中部的。铜藻完成生活史所需的净效积温为4 434.75°C·d,9月气囊开始出现时所需的净效积温为1 853.47°C·d,4月气囊生长发育达到峰值所需的净效积温为3 611.25°C·d。研究海域的海温变化主要受季风活动引起的海流变化影响,海水低温期后的升温条件可能是诱发铜藻快速生长的因素,较高的海温可限制铜藻的生长。     

繁殖期半叶马尾藻中国变种的形态结构观察

半叶马尾藻中国变种Sargassum hemiphyllum(Turn.)var.chinense J.Agardh是构成南麂海域生态系统重要的大型海藻之一,目前关于半叶马尾藻中国变种的形态学观察尚无报道。以南麂海域繁殖期的半叶马尾藻中国变种为对象,实地跟踪观察和制作组织切片相结合,对该藻的假根、茎、叶、生殖托、气囊的形态结构进行了观察描述和分析。其中通过对不同发育阶段的生殖托的观察,发现了生殖窝的发生特点以及性母细胞分裂为配子的方式。根据半叶马尾藻的营养结构观察,推测半叶马尾藻的髓质部分细胞大部分为死细胞,仅留胞壁结构起支撑作用,藻体表皮以下的一层紧密排列的柱状细胞才进行光合作用及其它生命活动。     

鼠尾藻幼苗的室内培养及有性生殖同步化

为了优化鼠尾藻幼苗生长与同步生殖的室内培养条件,实验以长度为5 cm左右的鼠尾藻幼苗为材料,在培养箱中给予不同的温度、光照强度和营养盐配比［KNO₃(mg)∶KH₂PO₄(mg)］等生长条件,通过跟踪测量生长情况,观察记录幼苗形态变化、生殖器官形成及生殖特点,寻找有利于幼苗室内生长和繁殖的适宜组合条件,实现生殖托提前发育和受精作用的同步化。实验结果表明,培养条件对鼠尾藻幼苗长度增长率的影响为温度>营养盐配比>光照强度;对质量增长率的影响为温度>光照强度>营养盐配比。培养温度越低气囊出现时间越早。侧枝的生成与营养盐配比具有一定的关系,总体上营养盐中KH₂PO₄所占比例越高侧枝出现时间越晚。生殖托生成的时间受到温度的影响最为显著。实验中受精卵的形成与脱落也明显受到温度的调节,温度越高生殖托生长越缓慢,卵受精时间越晚。光照越强藻体色素含量越低。室内培养的鼠尾藻完成繁殖过程比自然生长的个体提前3～4个月,并且平均每克藻体可以采苗约300棵。     

我国长江口及邻近海域铜藻生长和金潮分布变化特征

为了解金潮源头,对枸杞岛附近贻贝(Mytilus edulis)养殖区固着褐藻进行了分布特征调查,并对长江口附近海域漂浮金潮进行月度监测。结果表明,枸杞岛附近贻贝养殖区设施上固着生长大量褐藻马尾藻,1—3月,藻体具有固着器,营固着快速生长,平均长度在3月可达3.45 m;同时海区巡航监测结果显示,1—2月枸杞岛附近海域无漂浮马尾藻,3月份只有单棵零星漂浮藻体; 4月份,贻贝养殖区马尾藻固着器逐渐萎缩消失,导致藻体大量脱落进入海区,由于马尾藻具有气囊结构,能够保障藻体长期漂浮在海表面形成金潮;大面监测结果显示,4—5月海区漂浮褐藻生物量与分布范围快速增加,分布面积可达27761 km~2。分子生物学检测结果显示,固着褐藻和海区漂浮褐藻均为铜藻(Sargassum horneri)。本研究结果表明,3—4月浙江沿岸固着铜藻在人为和海流的共同作用下从贻贝养殖设施上脱落后营漂浮生活,生长聚集,并可能在风和海流作用下向北至黄海海域形成金潮,黄海金潮可能具有多溯源性质。     

硇洲马尾藻的繁殖特性及体长生物量的季节变动

广东特产的硇洲马尾藻是一种具有食用、药用价值的大型褐藻,有望开发成人工育苗栽培的新种类。2009年7月至2010年6月,原生态定点观察周年各月其体长和生物量等季节变动情况,结果发现,藻体假多年生,异株、异托。8—10月为体止期,11月至翌年4月中旬为生长期,4月中旬至6月初是繁殖期,6月初至7月底为衰老期。自然种群的繁衍和维持以假根再生为主,有性繁殖为辅。假根周年各月均可再生小苗,拔除假根,严重破坏种群繁衍,保留假根的剪收可以使第二年相同面积、同一时间的同种藻体的现存生物量明显增加。分布在水深2 m以内,宽5～10 m的潮间带岩礁上,11月开始加速生长,到5月上旬藻体长度生长达到最大值,原生态藻体的生物量表现出明显的季节变化,基本上与体长生长保持同步增长,最大生物量可达1 280 g/m²,最大单株藻体长1.73 m,最大单株质量可达250 g。     

充气培养对半叶马尾藻生长﹑营养盐吸收和生化组成的影响

将半叶马尾藻(Sargassum hemiphyllum)置于实验室球形培养瓶内培养15 d,设置5个充气速率(50 m L/min、100 m L/min、200 m L/min、400 m L/min和800 m L/min)为实验组,静水培养(0)为对照组。每隔5 d测定藻体的生长速率和营养盐吸收速率,培养实验结束时,测定藻体的色素含量、可溶性蛋白和可溶性糖含量。结果表明:充气速率和培养时间均对半叶马尾藻的生长和PO34--P的吸收具有显著影响,而对NO3--N来说,仅培养时间对其吸收影响显著。培养第1天时,充气可显著促进营养盐吸收,最大充气速率(800 m L/min)培养的半叶马尾藻对NO3--N和PO34--P的吸收速率分别比静水培养的马尾藻高133.77%和89.51%,生长速率也比静水培养的马尾藻高95.04%。随着培养时间的延长,充气速率对半叶马尾藻的生长和营养盐吸收的促进作用逐渐减弱。在培养第15天时,充气速率为800 m L/min条件下的半叶马尾藻对NO3--N的吸收速率比静水培养的马尾藻低24.87%,对PO34--P的吸收速率仅高出静水培养下的46.03%,而生长比静水培养的马尾藻高出75.16%。同时,除了可溶性蛋白含量,高充气速率可抑制叶绿素a(Chla)、类胡萝卜素(Car)和可溶性糖合成。因此,水体运动是通过对营养盐吸收及其他生理过程产生的作用间接影响半叶马尾藻的生长,而不是直接影响半叶马尾藻生长和产量的最重要因素。     

莫氏马尾藻繁殖生物学初步研究

观察了莫氏马尾藻在成熟季节雌、雄生殖托的繁殖特点、受精卵的形成、假根的发育、幼孢子体生长特征,并研究了不同附着基对采苗效果的影响。试验结果表明,莫氏马尾藻的繁殖盛期为4月中旬至5月中旬,其卵子发育属八核一卵型,假根是由基部一个细胞分化发育而来;瓷砖附苗的密度超过40株/cm2,在培育15d后,幼孢子体长度约1～2mm。     

鼠尾藻有性繁殖和幼孢子体发育的形态学观察

野外跟踪观测烟台芦洋湾地区鼠尾藻的成熟繁殖状况,采集临近成熟的鼠尾藻至实验室培养,跟踪观测其卵子的排放、卵子和受精卵的发育、假根的生长以及幼孢子体的前期发育。试验结果表明,本地区鼠尾藻繁殖期集中在6—8月,鼠尾藻的卵子发育属8核1卵型,卵子受精后约20 h开始脱离生殖托,受精卵先连续进行2次的横分裂,而后再由一端的1个细胞发育成假根,另外2个发育成体细胞。幼孢子体在约2 mm时开始形成分枝突起。     

烟台芦洋湾鼠尾藻种群生物量结构的季节变化

2005年2月至2006年1月对烟台芦洋湾鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的生长情况进行了生态学调查。实验设立固定样方观测了鼠尾藻种群结构的季节变化,采用逐步回归分析法分析了生境因子对鼠尾藻生物量的影响。结果表明,(1)鼠尾藻分布在低潮线以上50～125cm的中潮带和低潮带之间;(2)生物量消长和平均藻体长度消长的季节变化趋势一致,呈双峰曲线(7月份和12月份达到峰值,9月份达到最低值);(3)生活周期可以划分为4个时期:休止期、生长期、繁殖期和衰退期,6月中旬到7月下旬为有性生殖期;(4)营养生殖贯穿全年,并呈现一定的季节变化;(5)快速生长期内(5-7月),其大小级层次明显,近似正态分布;(6)水温为影响其生长的主要因素,其次为浪冲击度和人为干扰,干露对鼠尾藻的生长影响不显著。总之,本调查区域的鼠尾藻种群呈现明显的季节变化,并与其他海区种群差异显著,生长地区的环境因素是导致差异的根本原因。     

匍枝马尾藻人工栽培初步研究

为探索匍枝马尾藻(Sargassum polycystum)的人工栽培技术,采用浮筏式栽培方式于2015年3—6月在海南省儋州市海头镇进行了匍枝马尾藻的人工栽培试验,记录了该藻的生长规律,并通过栽培水深和夹苗密度试验,比较了不同栽培条件对其生长的影响。结果显示,3月下旬至5月下旬为匍枝马尾藻生长最旺盛的季节,其中藻体长度的快速增长主要集中在4月中旬以前,而藻体重量以相对稳定的速率持续增长至5月下旬。栽培水深和夹苗密度分别对匍枝马尾藻的藻体长度和分枝数有显著影响,而藻体鲜重则同时受到这两个因素的影响(P0.05)。研究表明,适量增加匍枝马尾藻的栽培水深和控制夹苗密度有利于促进其生长;为有效提高匍枝马尾藻的产量,栽培水深应设计为80 cm左右,夹苗密度控制在10 cm左右。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

近江蛏精子超微形态结构观察及与缢蛏精子的比较

利用扫描电镜和透射电镜分别观察了近江蛏和缢蛏成熟精子的超微形态结构。发现近江蛏精子与缢蛏精子在超微形态结构上差异很大。近江蛏精子为典型的原生型,成熟精子由头部、中段和尾部组成,头部包括顶体和细胞核。近江蛏精子与缢蛏精子顶体均为保龄球状,但近江蛏精子顶体全长比缢蛏短。近江蛏精子细胞核略扁圆形,外缘具8～9个圆弧形凸起；缢蛏精子细胞核则呈圆球状。近江蛏精子中段由线粒体和中心粒复合体构成,线粒体一般5个,个别4～6个；缢蛏线粒体5个或6个。近江蛏精子尾部为细长的鞭毛,轴丝为“9 2”结构,与缢蛏的相同。从近江蛏与缢蛏的精子形态差异看,两者应属于种间差异。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法，首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟，中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD， 896 kD和924 kD；3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD，都具有29 kD的轻链，其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明，3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性，在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别，而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示，3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应，但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应，这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的，而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

CYP3A65及上游核受体基因PXR和AHR2在斑马鱼生长发育阶段的表达

为了选择处于最佳生长阶段的斑马鱼用于药物代谢研究,本实验考察不同生长阶段斑马鱼全鱼、肝脏和肠道组织中CYP3A65及其上游核受体基因(PXR、AHR2) mRNA表达水平的变化规律。实验测定CYP3A65、PXR和AHR2相对表达量,并通过比较核受体基因与代谢酶基因mRNA之间的相关性来证实核受体基因的调控作用。结果显示,144 hpf和75 dpf两个生长阶段的斑马鱼中CYP3A65、PXR和AHR2 mRNA表达量最高;斑马鱼生长阶段中代谢酶基因和核受体基因的表达趋势一致,且受肝脏、肠道组织占全鱼比重的影响。研究表明,幼鱼期144 hpf斑马鱼及稚鱼期75 dpf的斑马鱼最适用于CYP3A65代谢研究;CYP3A65与PXR、CYP3A65与AHR2的mRNA表达之间有显著的相关性,与AHR2的相关性更显著。     

黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导鲫细胞凋亡的影响

为研究黄芪多糖(APS)和当归多糖(ASP)对维氏气单胞菌诱导鲫细胞凋亡的影响,实验设阴性对照组、阳性对照组,黄芪多糖组和当归多糖组,通过对鲫用维氏气单胞菌攻毒处理,用流式细胞仪测定血细胞的凋亡比例和细胞周期变化,并用荧光显微镜和透射电镜观察凋亡细胞的形态。结果显示,维氏气单胞菌攻毒后阳性对照组鲫血细胞的细胞凋亡率均极显著高于多糖组和阴性对照组;多糖组能显著降低鲫的细胞凋亡率且黄芪多糖组效果更显著;攻毒后鲫肝细胞和肾脏淋巴细胞出现染色质凝集、细胞核固缩边集和细胞空泡化及凋亡小体;同阴性对照组相比;维氏气单胞菌攻毒可以引起鲫血细胞周期中S/G2+M期细胞比例极显著下降,sub-G1极显著升高,抑制细胞分裂诱发凋亡;多糖组则G0/G1期细胞极显著降低,S/G2+M期细胞极显著升高,sub-G1极显著降低,促进细胞分裂抑制凋亡。黄芪多糖和当归多糖添加量在1%时能抑制维氏气单胞菌攻毒引起的细胞凋亡。     

橘色双冠丽鱼黑素皮质素受体1基因(MC1R)整胚原位杂交

为探究黑素皮质素受体1基因(MC1R)在橘色双冠丽鱼胚胎发育和体色形成过程中的表达定位及功能,本研究首先制备了MC1R基因的RNA正反义探针,T7方向转录的正义RNA探针质量浓度为447.529 ng/μL,SP6方向转录的反义RNA探针质量浓度为342.698 ng/μL。经10～20倍稀释后的探针用于原位杂交,MC1R基因探针表达定位显示,随橘色双冠丽鱼胚胎的发育杂交信号总体呈逐渐减弱趋势,原肠期和视泡期其卵黄和胚体侧卧部分有杂交信号分布;出膜期其脊柱、卵黄囊及其内容物和色素细胞内出现杂交信号;出膜期第1天,卵黄表面有信号分布。总体来看,杂交信号在脊索、卵黄囊、卵黄囊内容物质及色素细胞有特异表达,而以正义探针作为阴性对照组在5个胚胎阶段均无任何信号,杂交信号显现的MC1R表达定位说明其在橘色双冠丽鱼色素细胞的分化、迁移中起到重要调控作用,也与神经、营养、免疫功能相关,初步建立了鱼类体色相关基因功能和定位研究的整胚原位杂交方法。