中华绒螯蟹微卫星单引物扩增产物的初步分析

采用人工合成的 6个串联重复寡聚核苷酸单引物 ,以及 2个加锚的二核苷酸引物 ,利用SPAR和ASSR技术 ,对中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)基因组进行PCR扩增 ,结果发现 ,对于GC含量丰富的三、四核苷酸引物如(CGA) 5、(GACA) 4 ,在不同退火温度的PCR反应中 ,都能扩增出清晰的条带 ,可以作为PCR扩增引物 ;反之 ,GC含量 <5 0 %的 (CATA) 4 和 (GATA) 4 很难检测到扩增产物 ;在基本PCR条件下 ,2个加锚的二核苷酸引物能扩增出可分辨的条带 ,但随着退火温度的升高 ,其中部分条带消失 ;对于不加锚的二核苷酸引物如 (AC) 8、(GA) 8,无论怎样改变退火温度 ,终难形成清晰条带。将不同引物扩增产物分别克隆到T Vector上 ,选取其中 9个阳性克隆进行序列测定 ,发现在 (GACA) 4 引物扩增的 2个片段中 ,序列结构相似 ,除引物序列外 ,都出现了 2～ 3个内部重复序列和高含量的AT ;其余 7个片段在引物序列间都未见内部重复序列     

背角无齿蚌和三角帆蚌的rDNA基因ITS1及ITS2序列的初步研究

对背角无齿蚌(Anodonta woodiana woodiana)和三角帆蚌(Hyriposis cumingii)的核糖体RNA内转录间隔区1(ITS1)和内转录间隔区2(ITS2)进行扩增测序。结果显示,背角无齿蚌(A.woodiana woodiana)的ITS1长度为496bp(A:20.36%;T:25.40%;G:27.42%;C:26.82%);ITS2长度为466bp(A:24.89%;T:21.89%;G:26.39%;C:28.83%);三角帆蚌(H.cumingii)的ITS1为475bp(A:21.47%;T:23.79%;G:29.36%;C:25.48%);ITS2为519bp(A:25.82%;T:22.93%;G:25.24%;C:26.01%)。研究表明ITS在不同科的物种间差异较大,不适合用于高阶元的系统发育研究。背角无齿蚌、三角帆蚌、魁蚶、栉孔扇贝、大珠母贝5个物种的ITS2中有一段保守序列,推测可能与ITS的某一功能有关。     

鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证

为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA(eDNA)研究的鱼类引物,从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物,分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现,引物16s和COI均可以取得良好的扩增效果,通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带,引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现,只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果,能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现,16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段,COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上,我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类群落结构eDNA研究的通用引物。     

栉孔扇贝核糖体DNA转录间隔子序列研究及其潜在应用

以相应引物PCR扩增栉孔扇贝(Chlamys farreri)核基因组的核糖体DNA两个转录间隔子(ITS-1和ITS-2)，PCR产物经T载体连接后进行克隆、测序，分别得到了340bp和510bp的碱基序列，序列大小非常适合遗传变异及分子系统学研究。其A、T、G、C含量在ITS-1分别为32.06％，20.59％，22.35％和25.00％，在ITS-2分别为30.00％，21.37％24.12％和24.51％。这两个变异性较大的序列在扇贝种群中应用潜力很大，可广泛用于种内群体间遗传变异研究、种质鉴别及系统学研究。     

浒苔ITS区的扩增和分析

对来自东海-黄海海区10个站位以及青岛沿岸4个站位共14个站位的浒苔样品依据形态学特征,归类分离获得70个样品,对其ITS 5.8SrDNA区进行PCR扩增、测序和分析,并与NCBI数据库中相应序列进行了比对.结果表明,70个样品具有完全相同的ITS和5.8SrDNA序列,说明青岛沿岸漂浮的大量浒苔与东海-黄海海区的浒苔为同一个来源.聚类分析显示,浒苔ITS区的变异程度与地理间隔距离呈正相关,我国海域浒苔与日本海域浒苔聚类一起,与英国海域浒苔相聚较远,与美国海域浒苔距离最远.     

用PCR法快速筛选中国对虾含微卫星的重组阳性克隆

运用PCR在中国对虾的小片段基因组文库中快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆。PCR中使用的引物为载体pGEM-3(zf( )上多克隆位点两侧的T7／Sp6启动子引物和根据微卫星核心重复序列设计的STR引物：STR1：5‘-ATATATATATAT－3‘：STR2：5’－TCTCTCTCTCTC－3’，直接使用含有重组克隆的菌液，在PCR反应前增加一段裂解细菌的高温。筛选出来的含有微卫星序列的重组阳性克隆经DNA测序验证。结果证明，采用PCR方法用菌液快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆完全可行，而且具有简便、快速、高效、不涉及同位素操作等优点。     

11种鲈形目鱼类的核糖体基因GC含量及其与硬骨鱼类的特征比较

核糖体基因为串联重复多拷贝的基因,包括3个编码基因(18S,5.8S,28S)和两个间隔区ITS1(internal transcribed spacer 1)和ITS2(internal transcribed spacer 2)。目前,对核糖体基因的相关报道主要集中在个体内不同拷贝间的多态特征,以及其作为分子标记在系统演化关系中的应用,GC含量作为一项非常重要的核苷酸序列指标,而鲜有报道。为了探讨鱼类的核糖体基因GC含量特征以及间隔区是否也存在GC平衡现象,本研究选择了鲈形目(Perciformes)5科11种鱼类5个片段的核糖体基因进行研究,包括尖吻鲈科(Latidae)、射水鱼科(Toxotidae)、军曹鱼科(Rachycentridae)、剑鱼科(Xiphiidae)、鲹科(Carangidae)。获得了1651个单克隆序列,通过分析并比较已有的其他硬骨鱼序列片段的GC含量变化特征,结果发现:本研究鱼类的18S的GC含量为52.6%~57.1%(平均54.6%),5.8S为55.6%~58.9%(平均57.4%),28S为64.2%~65.8%(平均64.6%),ITS1为56.5%~73.0%(平均65.0%),ITS2为62.3%~77.5%(平均69.1%)。编码区的GC含量相对较保守,变异范围较小,18S和5.8S变化范围明显小于间隔区,28S则位于间隔区的最低值和最高值之间。因此,我们发现硬骨鱼核糖体ITS高于60%的GC含量是该类群的一个特征,并且高GC含量的ITS1和ITS2序列中不存在明显的高GC富集区,其含量高低的变化与序列长度也没有相关性。本研究11种鱼类的ITS1和ITS2的GC含量在种内的相似性既有大于也有小于种间相同片段的相似性,因此GC平衡现象只存在部分种类中。本研究结果可为鱼类核糖体基因序列特征的进一步研究及利用提供科学依据。     

刺激隐核虫PCR检测方法的建立

根据已知刺激隐核虫ITS序列设计引物,扩增刺激隐核虫ITS部分序列,并进行克隆、测序及序列分析建立刺激隐核虫PCR快速检测方法,检测DNA片段长度为387 bp,与福建长乐CL1209(KC550300)、福建福鼎FD1210(KC550302)、广东番禺PYH4.12株(DQ270010)、日本Wakayama分离株(AB608054)、台湾嘉义Chiayi株(AF490381)等序列同源性为100%,检测灵敏度为2个虫体。应用建立方法对2011-2013年收集到的50份患刺激隐核虫病的大黄鱼样品进行检测,结果与根据临床检测结果的符合率为100%。该检测方法的建立,为刺激隐核虫病的监测和诊断奠定了快速、简便、高通量的检测方法基础。     

4种鳕鱼线粒体16SrRNA、COI和Cytb基因片段序列的比较研究

对狭鳕(Theragra chalcogramma)、太平洋鳕(Gadus macrocephalus)、蓝鳕(Micromesistius poutassou)和远东宽突鳕(Eleginus gracilis)4种不同属鳕鱼的线粒体16S rRNA、Cytochrome oxidase subunit I(COI)和细胞色素b(Cyt b)基因片段序列进行了测定,分析比较了不同鳕鱼种间的序列差异.通过PCR扩增和序列测定,得到4种鳕鱼线粒体3个基因片段的总长度分别为539 bp(16S rRNA)、601 bp(COI)和385 bp(Cyt b),其基因片段的A+T含量都较高.4种鳕鱼种内个体间序列变异较小,3个基因片段的核苷酸替代速率依次为Cyt b＞ COI ＞16S rRNA.Cyt b 基因片段序列的分析结果显示太平洋鳕和狭鳕间分歧时间约为219万年,发生于中新世(Mio-cene);宽突鳕与蓝鳕间分歧时间约为653万年,发生在上新世(Pliocene).根据遗传距离构建的NJ系统树表明,狭鳕与太平洋鳕的亲缘关系较近,与蓝鳕的亲缘关系较远.     

中国、日本和澳大利亚珍珠贝的ITS 2序列特征分析

对中国、日本和澳大利亚的珍珠贝核糖体DNA第二内部转录间隔子(ITS2)的序列特征进行了分析。PCR扩增产物包括5.8S基因部分序列、ITS2基因和28S基因部分序列。去除引物序列后5.8S基因片段长64bp,ITS2长230～237bp,28S基因片段长249bp。共分析了16个基因型的序列特征,结果表明,5.8S和28S基因片段高度保守,仅28S有1个碱基位点突变;而ITS2变异大,237个比对位点中有20个位点发生突变,其中12个位点为缺失/插入突变,4个简约信息位点。在碱基组成中,5.8S和28S的GC含量(58.1%～59.4%)高于AT含量,也高于ITS2的GC含量(51.3%～52.0%),ITS2的GC含量与AT含量相差不大。碱基组成中5.8S的A碱基含量较低,28S的T碱基含量较低,存在较大的碱基偏倚性。3个地理群体内和群体间的遗传距离都很小(0.010～0.013),且相互重叠。从基因型数据看,3个群体既有各自独立的基因型,也有共享基因型。但从序列的碱基变异数据看,3个群体没有各自独有的突变位点。上述结果表明,3个地理群体既具有丰富的遗传多样性,又具有高度的遗传一致性,即亲缘关系近,可能存在基因交流,或者分化时间不长。丰富的遗传多样性有利于合浦珠母贝的遗传选育。     

珠母贝属6个种的ITS 2分子标记研究

对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、白珠母贝、黑珠母贝、长耳珠母贝、黑珠母贝和合浦珠母贝6个种的内部转录间隔区2(ITS2)序列及其两侧的5.8S和28S的部分序列进行了比较分析。其中黑珠母贝的序列来自GenBank。PCR扩增片段大小为600bp左右,测序结果表明,ITS2长211～254bp,两端的5.8S和28S分别长84bp和272bp(均含引物)。序列比对分析结果表明,5.8S和28S序列高度保守,不适合于种类鉴定,而ITS2序列高度变异,270个比对位点中有146个位点发生突变,其中72个位点发生插入/缺失突变。除白珠母贝和黑珠母贝之间的遗传距离较小外,其余种类之间的遗传距离远远大于种内遗传距离。基因型分析表明,每个种具有各自特有的基因型。基因型和序列变异分析表明ITS2序列可作为珍珠贝种类鉴定的分子标记。可用于种间、杂交育种、幼体和珍珠贝肉等材料的种类鉴定与遗传分析。     

东黄海沙海蜇群体线粒体COI基因序列多态性

采用聚合酶链式反应(PCR)技术对东黄海野生沙海蜇20个个体的mtDNA COI基因进行扩增,PCR产物经纯化后进行测序,结果经比对校正后,获得该群体COI基因片段序列,长度为473 bp;该序列中多态位点共6个,含简约信息位点1个,总变异为1.27%,碱基之间只存在转换,没有颠换、插入或缺失的位点;在测得的473 bp目的DNA片段中,碱基T、C、A、G平均组成分别为35.9%、19.0%、26.8%和18.2%,其A+T含量(62.8%)远高于G+C含量(37.2%)。在20个个体中共检测到6个单倍型,单倍型多样性为0.516,核苷酸多样性Pi为0.001 46。根据Kimura遗传距离的计算结果,各单倍型之间的遗传距离为0.002~0.006。利用COI基因序列构建的NJ系统发育树表明,东黄海野生沙海蜇与越前水母的亲缘关系较近,与海蜇的亲缘关系较远,进一步证明东黄海沙海蛰与越前水母应为同一物种;但在东黄海野生沙海蜇中检测到的6个单倍型中均为东黄海野生沙海蜇所特有,与日本越前水母单倍型不同,因此,两者可能仍属同一种的不同地理群体。     

基于COI和16S rRNA的库页岛马珂蛤遗传多样性和分子系统进化研究

本研究以库页岛马珂蛤(Pseudocardium sachalinense)为研究对象,讨论COI和16S rRNA两种DNA条形码在贝类的遗传多样性、分子进化和种类鉴定的适用性,并利用两种条形码评估库页岛马珂蛤的遗传多样性。本文在获得库页岛马珂蛤线粒体全基因组的基础上,测序获得库页岛马珂蛤群体的COI和16S rRNA序列,发现COI基因核苷酸多样性为0.00195,高于16S rRNA核苷酸多样性(0.00073)。基于COI基因的单倍型多样性为0.76,大于16S rRNA的单倍型多样性(0.318)。其次,用全线粒体基因组构建8种贝类的系统进化树为参考,发现基于COI和16S rRNA的系统进化树与参考一致,提示这两种条形码片段可用于推断贝类的分子进化关系。最后,分别对马珂蛤科和帘蛤科15属17种贝类的COI基因和16Sr DNA进行序列比较,发现COI基因和16S rRNA的种间遗传距离均是种内距离的62倍。以上结果说明,16S rRNA与COI基因一样,能有效地构建马珂蛤科和帘蛤科的系统发育关系和物种鉴定,但在分析库页岛马珂蛤的遗传多样性时利用COI基因比16S rRNA能发现更多的遗传变异。     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用，对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析，结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间，可以分为ITS1区，5.8S区和ITS2区3个部分，其中5.8S区片段的长度完全一致，均为160 bp；ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近，只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异，序列同源性在95.82％~99.73％之间，而5.8S区序列则完全一致，但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异，序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

Phylogenetic analysis of noxious red tide flagellates Chattonella antiqua, C. marina, C. ovata, and C. verruculosa (Raphidophyceae) based on the rRNA gene family

ABSTRACT:   Four species of Chattonella , which are well known to form red tides that are lethal to fish, were subjected to phylogenetic analysis on the basis of the ribosomal RNA genes (rDNA), 5.8S rDNA, 18S rDNA, 28S rDNA, and the flanking internal transcribed spacers 1 and 2 (ITS1 and ITS2). The 18S rDNA sequences of C. antiqua , C. marina , and C. ovata isolated from different regions in Japan were compared. They were found to be identical with each other in a sequence 1818 bp long. The sequences of the D1/D2 region in the 28S rDNA, 5.8S rDNA, and ITS region that are known to be more variable regions were also found to be identical. These homogeneities of the rRNA gene family revealed the extremely close relatedness of C. antiqua , C. marina , and C. ovata . The sequences of C. verruculosa were different from those of these three species , resulting in an 89.2% homology in the 18S rDNA sequences, 70.4% homology in the D1/D2 region in the 28S rDNA sequences, and an 81.5% homology in 5.8S rDNA sequences and the ITS regions. Chattonella verruculosa was grouped within a single cluster composed of Dictyochophyceae rather than the other species of Raphidophyceae.     

Genetic comparison between torafugu <Emphasis Type="Italic">Takifugu rubripes</Emphasis> and its closely related species karasu <Emphasis Type="Italic">Takifugu chinensis</Emphasis>

Abstract:   Sequence analyses of mitochondrial (mt) and nuclear genes were performed for genetic comparison between two Takifugu pufferfish species: torafugu T. rubripes and karasu T.  chinensis . With a sequence coverage of 20% in mtDNA, 640, 308, 344, 522 and 697 bp encoding mt 16S ribosomal RNA (rRNA), adenosine triphosphatase 6 ( ATPase 6 ), nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 4 ( ND4 ), ND5 and cytochrome b (cyt b ), respectively, among 24 wild torafugu, 24 wild karasu and six hybrid-like samples, 15% of the torafugu identified by external color patterns showed nucleotide sequences consistent with karasu. Meanwhile, sequences of 60% karasu were consistent with those registered for torafugu (AJ421455). As for the hybrid-like samples, two possessed karasu-specific sequences in some base positions while torafugu-specific sequences in others. The remaining hybrid-like samples possessed torafugu-specific sequences. On the other hand, the mt control region did not show such type of consistency. Analysis of nuclear melanocortin receptor genes ( MC1R , MC4R ) among 54 samples showed 99–100% inter- and intraspecific sequence identity. Partial nuclear 18S  rRNA, complete internal transcribed spacer 1 ( ITS1 ), partial 5.8S  rRNA and ITS2 genes showed similar levels of identity, indicating a very low level of variation in their respective gene fragments between the two Takifugu species.     

细胞核rDNA序列用于罗非鱼及其杂交种鉴别的初步研究

罗非鱼种间，尤其是尼罗罗非鱼与杂种尼奥罗非鱼之间，很难区分。本文对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和杂交种尼奥罗非鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）和红罗非鱼的核糖体DNA内部转录间隔子1（ITS1）序列及其两侧的18S和5．8s部分序列特征进行分析，以筛选种间鉴别标记。PCR扩增产物大小约700bp，测序结果表明，（去除引物后）18S长146bp，5．8S长66bp，不同种类之间无差异；ITS1长383-483bp，因种类不同而异，其GC含量大于AT含量，达到67．1％。序列比对分析结果表明，18S和5．8s片段高度保守，但各有3个变异位点可以把上述几个种和杂种相互区分开；18S序列上有一个UnbI限制性酶切位点，可作为尼罗和尼奥罗非鱼的鉴别标记。ITS1序列种间变异大，系统发育分析表明，所研究的5个种聚成2个类群，尼罗与尼奥罗非鱼为一组，莫桑比克-红罗非鱼-奥利亚罗非鱼为另一组。组内种间遗传距离较小，尼罗和尼奥罗非鱼的种间遗传距离为0．006；莫桑比克、奥利亚和红罗非鱼的种间遗传距离在0．007-0．009之间；两组罗非鱼之间的遗传距离较大，在0．030-0．035之间，表明罗非鱼ITS1序列多态性较高，适合于种类区分。结合部分18S和5．8S序列，细胞核rDNA具有鉴别罗非鱼及其杂种的潜力。     

11种鲈形目鱼类ITS2特征及系统应用

ITS2 (Internal transcribed spacer 2)是位于核糖体5.8S和28S基因之间的非编码序列。为了探讨该片段的多样性特征以及进化模式,本研究选取了鲈形目(Perciformes) 5科11种鱼类为研究对象,共获得了444条ITS2克隆序列,其长度范围为332～515 bp。比较种内不同序列的长度发现,金带细鲹(Selaroides leptolepis)在种内存在24 bp的差异,剑鱼(Xiphias gladius)在种内存在32 bp的差异,这2种鱼类的差异较为明显;其余9种鱼类的长度相对比较保守,长度差异小于14 bp。依据11种鱼类的保守位点数、变异位点数、简约信息位点数、单倍型数、保守位点比例、单倍型多样性指数、核苷酸多样性等特征分析发现,种内存在着不同程度差异,特别是金带细鲹的ITS2序列存在着Type A、Type B和Type C 3种类型,各类型间差异较大。根据序列的多样性特征推断,金带细鲹和剑鱼的进化方式为非协同进化;蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)、大甲鲹(Megalaspis cordyla)、吉打副叶鲹(Alepes djedaba)和日本竹筴鱼(Trachurus japonicas)的长度和变异位点均存在着一定程度的差异,但差异并不明显,视为不严格的协同进化;泰拉鰆鲹(Scomberoides tala)、布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、射水鱼(Toxotes chatareus)和军曹鱼(Rachycentron canadum) 5种鱼类为协同进化;另外,协同和非协同进化状态与分类系统没有相关性。序列比对发现,大甲鲹种内存在着由协同进化方式演变为非严格的协同进化方式的过度序列;在金带细鲹的3个不同个体中,序列间存在着从协同进化、非严格的协同进化演变为非协同进化的3种进化方式。基于ITS2序列构建的11种鱼类的邻接系统树显示,每种鱼类的克隆都分别按种单独聚为一支,鲹科7属鱼类各属也是单独聚支,表明ITS2不仅可以用在种类的分子鉴定,同时也可以作为分子标记应用于鲹科和属级水平的系统关系研究。