基于转录组数据的银鲴微卫星位点筛选

采用Illumina高通量测序技术对银鲴(Xenocypris argentea)肝脏组织进行转录组测序分析,筛选微卫星标记并进行多态性检验。共获得7 272个微卫星位点。随机选取48个4碱基以上重复类型的SSR位点进行引物设计和PCR验证,有47对可以扩增出清晰稳定的条带。在上述47个位点中随机选择26对在洞庭湖银鲴群体中进行多态性分析,结果表明,具有多态性的微卫星引物为21对。不同多态位点得到的等位基因数范围为3~15,平均基因数为7.29±3.94,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)以及香浓-威尔指数(H)平均值分别为0.532 7±0.211 4、0.613 6±0.196 4、0.564 6±0.198 0和1.302 0±0.577 9。21个微卫星位点中,有6个显著偏离哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)。     

基于Roche 454 GS FLX的钝吻黄盖鲽(Pleuronectes yokohamae)微卫星标记的开发

利用Roche 454 GS FLX平台测序技术进行了钝吻黄盖鲽微卫星引物筛选,并采用聚类分析的方法对得到的5641个微卫星位点进行类比分析,得到247种多态性位点,其中完美型占52.22%,非完美型占20.24%,复合型占27.54%,(AC)n、(AG)n两碱基重复类型的比例是44%,重复次数在10次以上的占总数的87.5%。随机选取11个位点的微卫星引物,采用5个野生个体,利用荧光标记和毛细管电泳进行多样性评价,4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡,不同位点得到的等位基因范围为3-8,平均等位基因数为5.0。平均观望杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)及平均多态性信息含量(PIC)分别为0.588、0.788和0.670。结果表明,454 GS FLX提供了一种直观、高效开发微卫星的方法。     

基于 Roche 454 GS FLX 的钝吻黄盖鲽(Pleuronectes yokohamae)微卫星标记的开发

利用 Roche 454 GS FLX 平台测序技术进行了钝吻黄盖鲽微卫星引物筛选,并采用聚类分析的方法对得到的5641个微卫星位点进行类比分析,得到247种多态性位点,其中完美型占52.22%,非完美型占20.24%,复合型占27.54%,(AC)n、(AG)n 两碱基重复类型的比例是44%,重复次数在10次以上的占总数的87.5%。随机选取11个位点的微卫星引物,采用5个野生个体,利用荧光标记和毛细管电泳进行多样性评价,4个位点偏离 Hardy-Weinberg 平衡,不同位点得到的等位基因范围为3?8,平均等位基因数为5.0。平均观望杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)及平均多态性信息含量(PIC)分别为0.588、0.788和0.670。结果表明,454 GS FLX 提供了一种直观、高效开发微卫星的方法。     

基于Roche 454 GS FLX的钝吻黄盖鲽(Pleuronectes yokohamae)微卫星标记的开发

利用Roche 454 GS FLX平台测序技术进行了钝吻黄盖鲽微卫星引物筛选，并采用聚类分析的方法对得到的5641个微卫星位点进行类比分析，得到247种多态性位点，其中完美型占52.22%，非完美型占20.24%，复合型占27.54%，(AC)n、(AG)n两碱基重复类型的比例是44%，重复次数在10次以上的占总数的87.5%。随机选取11个位点的微卫星引物，采用5个野生个体，利用荧光标记和毛细管电泳进行多样性评价，4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡，不同位点得到的等位基因范围为3?8，平均等位基因数为5.0。平均观望杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)及平均多态性信息含量(PIC)分别为0.588、0.788和0.670。结果表明，454 GS FLX提供了一种直观、高效开发微卫星的方法。     

富集文库－菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库─菌落原位杂交法,筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记.用固定了(AG)15和(AC)15探针的尼龙膜(Hybond N )捕捉含有微卫星DNA的片段,经洗脱、PCR扩增和TA克隆,构建栉孔扇贝的微卫星富集文库.利用ECL试剂盒(Amersham公司)标记的(AG)15和(AC)15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库,阳性克隆经测序获得微卫星DNA.富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后,532个(44.3%)为阳性克隆.任意挑选100个克隆测序,结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点.利用软件设计了65对特异性PCR引物,40对能扩增出清晰的带谱;利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点,分析表明37个位点具有多态性.不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等,37个多态性位点共获得258个等位基因,平均每个位点获得7.0个等位基因.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量值(PIC)的范围分别为0.1000～1.0000、0.1197～0.9831和0.1172～0.9782.结果表明,富集文库─菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记.     

基于RAD-seq技术的长体圆鲹二、三核苷酸重复微卫星标记开发与评价

通过对长体圆鲹(Decapterus macrosoma)基因组进行RAD-Seq高通量测序,共获得58 180条微卫星序列,选取112条二、三核苷酸重复的微卫星序列设计引物,经筛选后,共获得27个具有多态性的微卫星标记。利用一个长体圆鲹群体对通过筛选的微卫星标记的种群遗传学特征进行评价。结果显示,27对引物扩增的序列中18个位点为二核苷酸重复,重复次数为9～14次,9个位点为三核苷酸重复,重复次数为6～10次,等位基因数(Na)为5～17 (平均10.6),表观杂合度(Ho)为0.342 9～0.857 1 (平均0.631 7),期望杂合度(He)为0.538 3～0.911 8(平均0.796 8),多肽信息含量(PIC)为0.497～0.886 (平均0.780 9),除1个位点外,其他位点PIC值均大于0.500,表明开发的微卫星位点具有较高的多态性。"哈迪-温伯格"平衡(HWE)检测结果显示,19个标记等位基因频率符合HWE。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。该研究开发的27个微卫星标记可为长体圆鲹种群遗传学研究提供基础。     

军曹鱼全基因组微卫星特征分析与多态性标记的筛选及应用

为更好地开发军曹鱼(Rachycentron canadum)高多态性微卫星分子标记,本研究基于军曹鱼全基因组测序结果,利用MISA1.0软件对其简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)的位点信息进行检索及分析。结果显示,基因组中共筛选出1~6个核苷酸为重复单元的SSR位点344 820个,其中,以单核苷酸重复序列最多(174 146个),占SSR总数的50.50%;其次为二核苷酸重复和三核苷酸重复序列,分别占SSR总数的30.23%和14.02%。在SSR包含的重复单元中,单核苷酸重复以A/T类型为主,AC/GT是二核苷酸的优势重复单元类型。军曹鱼基因组SSR核心序列重复次数在4~275次范围内波动,单核苷酸SSR重复数为10的最多,二核苷酸SSR重复次数为6的最多。本研究设置长度≥12 bp为筛选高多态性SSR位点的标准,共获得361 684个位点。在上述位点中随机选取100个候选位点进行基因分型检测,利用从中筛选到多态性较高的10个SSR标记分别对北海、陵水、硇洲、徐闻和三亚5个养殖群体进行遗传多样性分析,145尾个体中共检测到69个等位基因,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)平均值分别为0.628、0.706和0.653。相关研究表明,军曹鱼基因组中SSR位点类型较为丰富、多态性潜能较高,从中筛选获得的多态性SSR标记可为军曹鱼分子标记辅助育种、群体遗传多样性评价等研究提供有力支持。     

鲤雌核发育子代基因的杂合度分析

通过热休克法抑制第一次有丝分裂(抑制第一次卵裂)和减数分裂(抑制第二极体排除),分别获得鲤(Cyprinus carpio L.)的2个雌核发育家系.利用13对具有高多态性的微卫星分子标记,分别对2个雌核发育家系的观测杂合度(Ho、期望杂合度(He)、等位基因频率(P)和有效等位基因数(Ne等进行遗传背景调查.结果表明,抑制第一次有丝分裂家系的等位基因频率为0.063～1.000,平均观测杂合度为0.22,平均期望杂合度为0.24,平均有效等位基因数为1.41,该家系在6个微卫星座位上表现为纯合子,在7个微卫星座位上表现为杂合子,其中位点MFW4完全表现为杂合子;抑制减数分裂的等位基因频率为0.056～0.889,观测杂合度的平均值为0.37,期望杂合度的平均值为0.47,平均有效等位基因数为1.93,该家系中没有得到完全纯合的个体,其中在2个位点上全部表现为杂合子.在所分析的鲤雌核发育群体中,有3个基因座位(HLJ034、HLJ044和HLJ071)有重组现象,重组率为20.00%.综合上述结果推断,鲤2个雌核发育家系在个体和群体上都具有一定的基因杂合性.[中国水产科学,2009,16(1):47-53]     

中国鲤几个代表种群基因组DNA遗传多样性分析

中国鲤具有悠久的养殖历史和重要的经济价值,无论是天然种群还是养殖品种,年产量远超过其它鱼类。近几十年来,养殖新品种的开发获得成功,大大提高了产量,改善了品质。但是由于盲目的开发利用,许多重要的鲤养殖种类的种质资源遭到破坏。"江西三红"(Cyprinuscarpiovar.xingguonensis、Cyprinuscarpiovar.wuyuanensis、Cyprinuscarpiovar.wananensis)、黄河鲤(Cyprinusycarpiovar.)和黑龙江野鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)是中国鲤几个具有代表性的养殖品种和野生种,在我国鲤鱼遗传育种研究中均占有非常重要的地位。应用第二代分子标记,即微卫星标记(microsatellite)84个,对以上5个具有代表性的中国鲤进行了全基因组DNA检测。结果表明,当退火温度提高至60℃时,有43对标记引物扩增出清晰的条带,其中有14对在群体间呈现多态性,扩增等位基因位点为2～4个。微卫星座位MFW4,MFW19,MFW23和MFW26在群体内显示了高度的多态性,扩增等位基因位点为7～13个。统计实验结果发现,"江西三红"3个品种间遗传差异较小,兴国红鲤和荷包红鲤的亲缘关系较近(0.93);属于同一亚种不同地理种群的黄河鲤和黑龙江野鲤具有较高的遗传相似性(0.89)。另外,根据微卫星多态性分析结果,探讨了这5种鲤的遗传多样性。     

基于胡鲇科和鲇科ESTs序列初步筛选兰州鲇EST-SSR分子标记

利用SSRHunter软件对现已公布的鲇形目(Siluriformes)中胡鲇科(Clariidae)和鲇科(Siluridea)共2002条EST(Expressed Sequence Tag)序列筛选兰州鲇(Silurus lanzhouensis)微卫星标记,并分析其序列丰度和分布特征。结果共发现209个微卫星序列,占整个ESTs数据库的10.44%;其中三碱基重复序列数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的35.62%;二、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的28.31%、25.57%、7.76%、2.74%。根据侧翼序列,设计125对引物,随机选取58对进行扩增鉴定及多态性筛选。结果显示29对引物能稳定扩增,16对引物具有多态性,每个位点等位基因数2~7个(平均3.75),观测杂合度(Ho)0.133 2~0.732 2(平均0.405 1),期望杂合度(He)0.198 2~0.848 3(平均0.560 2),多态信息含量(PIC)0.124 1~0.794 5(平均0.506 5)。研究表明,借用已有鲇形目鱼类ESTs数据库筛选到的兰州鲇微卫星标记质量较好,可为兰州鲇种质资源保护、微卫星连锁图谱构建、经济性状的QTL定位及分子标记辅助育种奠定基础。     

基于转录组测序的圆口铜鱼SSR标记初步筛选及特征分析

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq? 2000 高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星（SSR）位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条 unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5~60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11~15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11~101 bp,其中12~35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR 扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

广西野生鲤与建鲤的遗传多样性分析

利用10个微卫星标记,对2代群体选育的建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)和封闭水体的广西野生鲤鱼进行遗传多样性分析,共检测到53个等位基因,等位基因位点数在4~7个之间,平均等位基因数5.3个,片段长度在118~284 bp之间,有效等位基因在1.167 5~1.520 3,平均为1.360 2,广西野生鲤群体的有效等位基因数1.562,大于建鲤的1.388;位点观测杂合度在0.397~0.762之间,平均为0.562 6,期望杂合度0.301~0.629之间,平均0.463 3,广西野生鲤群体的期望杂合度0.581,大于建鲤的0.473;微卫星位点多态性信息含量(PIC)在0.289 7~0.685 0之间,平均多态信息含量0.438 8,为中度多态性,广西野生鲤群体多态信息含量0.685,大于建鲤的0.424,两个群体平均基因分化系数为0.106 9,广西本地野生鲤与建鲤的遗传距离为0.1463,相似性系数为0.828 4,表明广西野生鲤与建鲤之间存在明显的遗传异质性。     

源于鳞被相关基因的微卫星标记与鲤 4 种生长性状的相关性分析

选用来源于鲤基因组中的鳞被相关基因(ant、eda、edar、fgfr)及其上下游序列中的155个微卫星标记,对德国镜鲤(Cyprinus carpio L.)与黑龙江野鲤(Cyprinus carpio haematopterus)杂交的F2 116尾个体的遗传多样性进行检测,以卡方检验估计群体Hardy-Weinberg平衡.结果表明,36个微卫星标记表现为多态,各标记的等位基因数在2～4个浮动,共检测到86个等位基因,平均每个标记2.388 9个;平均有效等位基因数为2.209 4;平均观测杂合度为0.624 5;平均期望杂合度为0.529 2;平均多态信息含量为0.432 1,其中23个微卫星标记表现为中度多态(0.25≤PIC＜0.5),13个微卫星标记表现为高度多态(PIC≥0.5),说明这个群体属于中度多态性水平.Hardy-Weinberg平衡检验结果显示,61％标记显著偏离平衡,人工选择压力和自交对家系造成了严重的影响.SPSS 17.0分析发现分别有10(28％)、7(19％)、7(19％)和11个(31％)标记与体质量、体长、体高和体厚存在显著相关性,并发现11个优势基因型.源于鳞被相关基因的微卫星标记与生长性状连锁的比例较高,以上结果从分子水平上提示鳞被基因与所研究4种生长性状存在一定的相关性.     

从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究

利用生物信息学方法在含有10446个中国对虾ESTs的数据库中进行微卫星序列的筛选，共发现微卫星序列229个，占整个ESTs数据库的2．19％，其中含双碱基重复序列146个和3碱基重复序列58个，分别占在ESTs数据库中发现微卫星序列总数的63．76％，和25．33％，大部分发现的微卫星序列均为Perfect形式的重复序列。根据筛选得到的微卫星序列设计并合成引物19对进行多态性检测，在有扩增产物的16对引物中，首次筛选得到8个中国对虾微卫星标记，并对这些微卫星标记进行了等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等统计学指标的评价。结果表明，在8个微卫星位点上，等位基因的数目从5到15不等，等位基因长度从：165～305bp，期望杂合度和多态性信息含量分别为0．59到0．89和0．56到0．88，表明这8个中国对虾微卫星标记完全适合于遗传分析。     

长江草鱼多态微卫星位点的分离及后备亲鱼的遗传多样性分析

本研究采用磁珠富集法分离了10对具有多态性的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)微卫星位点,并对140条长江野生草鱼组成的后备亲鱼群体的遗传结构进行了分析。结果显示:本试验得到的草鱼微卫星序列主要是以2个碱基为重复单位、重复次数在5～22之间的多重复单元,重复次数在10次以上的微卫星序列较易得到多态性;77个微卫星座位中,完美型、非完美型和混合型微卫星标记所占的比例分别为87.01%、2.60%和10.39%;群体遗传分析显示,10个多态性微卫星座位中,除了GC39座位外,其它座位都符合哈迪-温伯格平衡,适用于草鱼群体的遗传结构分析;每个座位检测到3～8个等位基因,平均有效等位基因数为3.9302,多态信息含量在0.4129～0.8107之间变动,平均为0.6678,除了GC78座位为中度多态外,其他9个座位均为高度多态。基因分化系数、Shannon指数、平均观测杂合度和平均期望杂合度的平均值分别为0.3457、1.4262、0.9511和0.7193,表明该群体的遗传多样性比较丰富。     

栉孔扇贝BES-SSR的开发及遗传多样性分析

通过分析栉孔扇贝BAC末端序列,发现大量微卫星DNA;随机选择14个多态性BES-SSR标记,在我国栉孔扇贝大连群体(DL)和青岛群体(QD)中验证标记的可用性,同时对这两个群体的遗传结构及其分化进行研究。结果表明,从17447条BESs中得到微卫星3374个,以四核苷酸重复为主(26.6%),五核苷酸重复次之(17.7%),六核苷酸重复最少(12.0%)。BES-SSR引物的扩增效率为77.3%(99/128),在作图亲本中的多态比例为33.6%(43/128),14个基因座在两群体中的平均等位基因数Na分别为18.9286和26.2143,平均有效等位基因数Ne为11.7505和17.0891,平均观察杂合度Ho为0.5100和0.4204,平均期望杂合度He为0.9156和0.9450,多态信息含量PIC分别为0.8940和0.9302,群体遗传多样性水平较高。两群体间的无偏遗传相似性系数为0.4879,遗传距离为0.7177,平均基因分化指数FST为0.0243,基因流Nm为10.0179,显示群体间遗传分化程度较弱,遗传变异主要来自于群体内个体之间,经Hardy-Weinberg平衡检验,两群体普遍存在杂合子缺失现象。研究表明,所开发的BES-SSR是高度多态位点,用于群体遗传多样性分析效果很好,显示BES是微卫星标记开发和应用的重要资源。     

Characterization and genomic annotation of polymorphic EST‐SSR loci in Litopenaeus vannamei shrimp

In the present work, EST‐SSR (expressed sequence tag‐simple sequence repeat) loci were obtained by screening 45 000 ESTs from the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei, which was available in a database of the ShEST (Shrimp EST Genome Project) consortium. Fifty‐two of 600 EST‐SSR loci were selected. From this total, 21 EST‐SSRs were polymorphic among 40 individuals and had their gene products ascribed. Two to 20 alleles per locus were detected and the observed heterozygosity ranged from 0.15 to 0.86. Eight loci presented a significant heterozygote deficit after the Bonferroni correction, which was attributed to null alleles. Seven loci were able to have their protein products, molecular functions and biological processes determined. Our results are promising for future studies that relate the levels of these gene polymorphisms with different biological responses to stress in aquaculture.     

鲤回交群体4种生长性状的相关性分析

利用132对SSRs(simple sequence repeat)标记和63对在EST(expressed sequence tag)上的微卫星标记对柏氏鲤和荷包红鲤抗寒品系回交子代的84个个体基因组DNA进行检测,共得到565个等位基因,各等位基因数2～4个,片段长度72～484 bp,平均等位基因数为2.897 4,平均多态信息含量为0.584 9,平均杂合度为0.592 8。利用统计软件SPSS的GLM程序对195个微卫星标记与鲤体重、体长、头长和尾柄长的相关性进行分析,其中HLJ133、HLJ346、HLJ360与体重具有极显著相关；HLJ133,HLJ368,HLJ390,HLJ673,HLJE96与体长具有显著相关；HLJ133,HLJ346,HLJ360与头长极显著相关；HLJ529,HLJE538,HLJE586与头长具有显著相关；HLJ673,HLJE282与尾柄长具有极显著相关；HLJ348,HLJ368,HLJ382,HLJ437,HLJ483,HLJ752,HLJE169,HLJE586与尾柄长具有显著相关,并对同一标记不同基因型间进行了多重比较。根据实验求出的体重与体长、头长、尾柄长之间的相关系数和通径系数,可得知体重与尾柄长的直接相关性非常小。     

文蛤30个微卫星标记的开发及在斧文蛤和帘文蛤

利用磁珠富集法构建的基因组文库和EST文库开发了30个文蛤多态性微卫星标记。8个G-SSR和22个EST-SSR多态性位点共获得140个等位基因,平均等位基因数为4.67,多态性信息含量、观测杂合度、期望杂合度分别介于0.172~0.744、0.040~0.720、0.187~0.793之间;G-SSRs的平均等位基因数、平均多态性信息含量、平均观测杂合度和平均期望杂合度都较EST-SSRs高;Hardy-Weinberg平衡检测发现,24个位点偏离了平衡状态;利用BLASTx对含多态性SSR位点的EST进行功能注释,11个位点来自注释基因序列。 将30对文蛤多态性SSR引物分别在斧文蛤和帘文蛤中进行了通用性检测,通用率分别为30%和40%。这些微卫星多态性位点的获得,为进一步开展文蛤遗传多样性分析、种质资源评价、分子标记辅助选育等奠定基础,并且可用于文蛤、斧文蛤和帘文蛤的比较作图、基因发掘和QTL定位等研究。