剑尾鱼卵黄脂磷蛋白的纯化及免疫分析

采用Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱和HiTrap Q阴离子交换柱从卵黄生成期的雌性剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白(Lv)。已确定被纯化的剑尾鱼Lv在Native-PAGE(4%~7.5%)电泳中分子量为530 kD左右。Native-PAGE(4%~7.5%)电泳后的凝胶分别进行糖蛋白染色、脂蛋白染色及磷蛋白染色。结果表明,剑尾鱼Lv是一种富含糖、脂、磷的蛋白。用纯化的剑尾鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清。用免疫双扩散的方法测定Lv抗血清的效价为l∶32。Western-blotting检测显示抗血清的特异性较好;卵黄蛋白原(Vtg)和Lv抗血清之间存在明显的免疫交叉反应,表明Vtg和Lv两者具有相同的免疫原性。免疫双扩散检测表明,抗Lv血清表现出明显的雌性特异性和种的特异性。     

瓦氏黄颡鱼卵黄脂磷蛋白(Lv)的纯化、性质鉴定及其抗血清的研制

采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从瓦氏黄颡鱼Ⅳ期卵巢粗提液中分离、纯化出卵黄脂磷蛋白(Lv),采用糖、磷、脂蛋白染色技术验证分离、纯化的蛋白为Lv,该Lv在非变性条件下分子量约为230ku,在SDS变性条件下分子量约为106ku。纯化的瓦氏黄颡鱼Lv经检测显示含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Lv,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Lv多克隆抗血清。通过双向免疫扩散法测得Lv抗血清的效价为1∶32,还发现瓦氏黄颡鱼卵黄蛋白原(Vtg)和Lv之间有明显的免疫交叉反应性,说明两者具有相同的免疫原性;Western-blotting检测显示抗血清的特异性较好,并能特异性地识别Vtg。     

大阪鲫鱼血清雌性特异蛋白的鉴定

鱼类是在卵母细胞外合成卵黄的动物，具体说是在肝脏中合成的，经过血液循环输送到卵母细胞，首先在肝脏中合成的是卵黄蛋白的前体——卵黄蛋白原(Vitellogenin)，卵黄蛋白原在雌激素作用下，雌体血清中就会出现一种雌性特异蛋白成分，K．Aida(1973)称此蛋白为血清雌性特异蛋白。近年来，作者在鱼类血液分析方面的工作证明，雌雄鱼血清存在差异是普遍的，并利用醋酸纤维薄膜电泳对雌性特异蛋白化学特性进行了鉴定。     

剑尾鱼卵黄蛋白原基因片段克隆、表达及蛋白检测方法的建立

本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法.根据已发表的底鳉(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1 118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底鳉和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%.在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白.表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后,SDS-PAGE分析有29 kD的表达蛋白产生,与预期相符.以重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗血清.雌激素(β-雌二醇)对剑尾鱼诱导后,用重组蛋白抗血清作一抗,进行Westernblot分析.结果表明,该抗血清能与剑尾鱼卵黄蛋白原特异结合,可应用于剑尾鱼卵黄蛋白原的检测.卵黄蛋白原是环境雌激素研究中较为特异、灵敏的生物标志物,剑尾鱼卵黄蛋白原检测方法的建立,为剑尾鱼环境监测应用提供良好基础.     

不同倍性虹鳟卵黄蛋白原的组织定位

采用分步沉淀法提纯虹鳟卵黄蛋白,以同发育期二倍体虹鳟为对照,用免疫组化法对不同发育阶段的三倍体虹鳟性腺、肝脏、血液和肠道进行卵黄蛋白原(Vg)的细胞化学定位研究.试验结果表明:所纯化蛋白为与卵黄蛋白原具有相似免疫原性的卵黄脂磷蛋白,呈雌性特异性.性腺发育Ⅲ～Ⅴ期的二倍体雌性虹鳟,血液和肝细胞呈卵黄蛋白原阳性,Ⅳ～Ⅴ期卵巢呈卵黄蛋白原阳性,各发育期肠组织呈卵黄蛋白原阴性;性腺发育至Ⅰ～Ⅴ期的三倍体雌雄虹鳟及雄性二倍体虹鳟,其性腺、肝脏、血液和肠道组织呈卵黄蛋白原阴性.二倍体虹鳟外源性卵黄蛋白原在肝细胞内合成,经血液运送至卵巢,最终在卵母细胞中形成卵黄颗粒.由于三倍体雌性虹鳟卵巢发育受阻,无滤泡细胞分化,生殖细胞与体细胞的互作缺失,不能分泌足量的17β-E2以诱导Vg的合成,因而肝脏的Vg阴性并不能说明肝脏不具备合成Vg的能力,从卵黄发生的角度分析,卵黄蛋白原的缺乏不是导致三倍体虹鳟雌性不育的原因,而是其卵泡败育的结果.     

牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

运用Sephacryl S-200凝胶层析和HiTrap rProtein ASepharose亲和层析2种方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清免疫球蛋白进行分离纯化,结果表明,牙鲆免疫球蛋白分布于33%~50%的硫酸铵饱和溶液中,其中45%的分离效果最好。凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰,用还原SDS-PAGE检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰中。牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75.4 kD,轻链分子量约为29.9 kD和28.2 kD,推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量为836 kD。制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为1∶32,免疫斑点法检测多克隆抗体效价至少为1∶1 600。运用免疫印迹法(Western-bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性,实验证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法，首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟，中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD， 896 kD和924 kD；3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD，都具有29 kD的轻链，其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明，3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性，在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别，而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示，3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应，但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应，这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的，而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

尼罗罗非鱼卵黄脂磷蛋白的分离纯化与性质鉴定

采用Sephacryl S-300过滤层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析相结合的方法从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)成熟卵子匀浆液中分离纯化出了一种高分子量的蛋白。该蛋白能被Schiff试剂、甲基绿和苏丹黑B着色,Western blot显示能被金鱼卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)多克隆抗血清特异性识别,在非变性条件下分子量约为560 k D,在SDS变性条件下分子量约为112 k D,结果表明分离纯化的蛋白是一种含有糖、磷、脂基团的蛋白,符合鱼类Lv的性质,且与金鱼Lv有免疫交叉反应,从蛋白的性质和免疫原性以及分子量大小等角度判断,本研究获得的高纯度蛋白为尼罗罗非鱼卵黄脂磷蛋白;纯化的罗非鱼Lv在反复冻融、37℃及60℃处理条件下均未出现降解,表明罗非鱼Lv比鱼类卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vtg)更为稳定。研究结果为罗非鱼Lv抗体的制备奠定了基础。     

小体鲟血清卵黄蛋白原和 Ca2+浓度与卵巢发育的关系

采用ELISA方法、分光光度计法和组织学方法,系统研究了不同年龄小体鲟(Acipenser ruthenus)血清卵黄蛋白原(Vitellogenin Vg)、血清钙离子(Galcium Ca2+)含量与卵巢发育变化的关系.结果表明:血清Vg浓度、Ca2+浓度与卵巢的发育时期相关;在卵黄沉积期内,血清中Vg浓度与Ca2+浓度呈线性正相关(R2=0.926 4);卵黄生成前期和沉积初期,血清中Vg浓度和Ca2+含量较低;卵黄沉积期内,卵母细胞由沉积初期的0.56 mm 增大到卵黄沉积末期的2.0l mm,血清Vg质量浓度由110.65 μg/mL 上升到242.22 μg/mL,血清Ca2+浓度由2.34 mol/L增大到2.72 mol/L.对同年龄的雌、雄小体鲟血清Vg浓度和Ca2+浓度测定表明,根据血清中Vg和Ca2+含量差别,可以区分出沉积期小体鲟的性别.     

施氏鲟卵黄蛋白的分离纯化及其性质

采用组织匀浆、饱和硫酸铵分步沉淀和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析的方法提取和纯化施氏鲟卵黄蛋白,并对其性质进行了研究。结果表明:采用50%和70%饱和度的硫酸铵分步沉淀与Sephadex G-100凝胶层析相结合的方法,可以获得一种卵黄蛋白纯品。Native-PAGE和SDS-PAGE分析表明,该纯化蛋白纯度为100%,由一种同源亚基组成,其亚基的相对分子质量约为30 kD。油红O、免疫印迹(Western-blot)和罗丹明B染色均为阳性,表明该蛋白为施氏鲟卵中的一种脂磷蛋白。     

河川沙塘鳢卵母细胞发育过程中卵黄脂磷蛋白的变化

采用酶联免疫检测和免疫印迹技术研究河川沙塘鳢卵巢发育过程中的卵黄磷脂蛋白结构和含量变化情况。河川沙塘鳢卵黄磷脂蛋白的分子量为440 kD,免疫印迹结果显示其由3个亚集团组成,分子量分别为95-105 kDa、41.3 kDa和30.7 kDa。7-9月卵巢中不含卵黄脂磷蛋白,10月起开始累积,翌年3月达到最高值,4-5月仍保持在较高水平,其后显著降低,水溶性总蛋白年变化周期也表现出相似的趋势,但是在7-9月有一个的基本量。试验结果表明,河川沙塘鳢卵巢在10月已经开始发育,比形态观察结果提前10个月。雌性河川沙塘鳢在10月起开始启动水溶性蛋白质特别是卵黄磷脂蛋白的合成,并逐渐累积至翌年3月,3月起开始进入繁殖期,4-5月为产卵高峰期。     

A novel technique for the separation of yolk from the developing embryonic tissue in a teleost fish, Oncorhynchus mykiss

We have developed and validated a novel technique that allows for a relatively quick and efficient isolation of embryonic tissue from the yolk in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. After removal of the chorion, the yolk is first dissolved in an imidazole-KCl buffer and separated from the embryo proper and yolk sac (tissues) by centrifugation. SDS gel was used to identify proteins of 165, 48, 35 and 10 kDa unique to the embryonic tissue and a 6 kDa protein unique to the yolk. Using protein analysis and enzyme activity measurements (lactate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase) of each fraction, we have determined that cross contamination is less than 10%. This new method will facilitate biochemical studies of the embryo and yolk that were previously very time consuming. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

光棘球海胆的主要卵黄蛋白cDNA序列分析

提取成熟光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)性腺中的RNA做模板,根据NCBI数据库中已知海胆(编号:AB097218、AB192414、AY090112)主要卵黄蛋白MYP cDNA保守序列设计引物,用LA PCR方式分段扩增并测序得到了光棘球海胆MYP cDNA的全序列。扩增的cDNA全长4 061 bp,包含4 047 bp的开放阅读框,共编码1 349个氨基酸。用CluxtalX1.83对光棘球海胆与其他几种已知海胆MYP cDNA及推导的氨基酸序列进行比对,用Mega3.01计算遗传距离及构建进化树,结果表明,光棘球海胆与其他7种海胆的MYP具有高度的同源性。从氨基酸水平上看,光棘球海胆与红海胆(Pseudocentrotus depressus)亲缘关系最近,遗传距离为0.069±0.01;与同科的马粪海胆(Hemicentrotus pulcher-rimus)、紫球海胆(S.purpuratus)、中间球海胆(S.intermedius)的遗传距离分别是0.095±0.012、0.098±0.011和0.101±0.012;与白棘三列海胆(Tripneustes gratilla)、拟球海胆(Paracentrotus lividus)及绿海胆(Lytechinus variega-tus)亲缘关系相对较远,遗传距离分别是0.216±0.017、0.218±0.017和0.535±0.028。获得光棘球海胆MYP cDNA序列可为进一步研究MYP基因的功能和系统的进化分析奠定基础     

Ontogeny of thyroid tissue and tissue thyroid hormone clearance in rainbow trout embryos reared at two temperatures

The development of the thyroid tissue and clearance of thyroid hormones was studied in rainbow trout embryos reared at 8.5 and 5.5 °C, in order to determine if these events are affected by temperature in the same manner as growth rate. Although the change in growth rate was found to be predictable using the degree-day model, the pattern of whole body thyroid hormone clearance was not similarly related to rearing temperature. Further, although the thyroid follicles appeared at different times in embryos reared at the two temperatures, the differences could not be predicted using the degree-day model. These results suggest that the development of the thyroid tissue and the clearance of yolk hormones are not directly related to rearing temperature. Immunohistochemical staining of the thyroid tissue indicated two phases of thyroid activity, one associated with hormonogenesis, and the other a later phase of hormone release. However, there was no increase in 'whole body' thyroid hormone level associated with the time of appearance of colloid in the follicles. Further, evidence was presented to suggest that the extraction method used did not remove thyroid hormone associated with the colloid in the follicles. There was also evidence of sporadic increases in 'whole body' thyroid hormone content, after the development of phase 2 thyroid follicles which might indicate pulsatile release of T4 and T3.     

刺参主要卵黄蛋白MYP1、MYP2在不同幼体发育阶段、成体组织及温度胁迫条件下的相对定量表达

为探讨温度胁迫对刺参基因表达的影响,从已构建的刺参耐寒基因筛选cDNA文库中选取差异基因主要卵黄蛋白(major yolk protein,MYP):MYP1和MYP2,利用实时荧光定量PCR研究了其在刺参胚胎发生和个体发育9个阶段(受精卵、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽形幼体、五触手幼体和稚参)、成体7种组织(呼吸树、体腔液、肠、纵肌、体壁、雄性性腺和雌性性腺)、长时温度胁迫(20℃、4℃,30 d)和低温短时胁迫(7℃、4℃、1℃、-2℃,12 h)成体肠组织中的表达量。结果发现,MYP1和MYP2表达模式基本相同:(1)在胚胎发育阶段樽形幼体时期开始表达,随后的阶段持续表达,到稚参阶段表达量最高;(2)在7种组织中,肠中的表达量最高,在体腔液中基本不表达,其余组织中均有表达;(3)在长时(30 d)温度胁迫下,肠组织中MYP表达量由高到低依次为4℃、12℃、20℃,且在4℃的表达量为20℃的6倍左右;(4)在低温短时胁迫(1℃、-2℃,12 h)条件下,肠组织中MYP表达量受到显著抑制,约为常温条件下的一半。研究表明,MYP在刺参胚胎发育的樽形幼体阶段开始合成,成体合成部位主要为肠,水温过低会抑制其表达。     

太平洋牡蛎卵母细胞发育及卵黄发生的超微结构

利用透射电镜观察了太平洋牡蛎（ Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ） 卵母细胞的发育及卵黄发生。卵母细胞的发育可分为卵黄合成前卵母细胞与卵黄合成期卵母细胞２ 个阶段。卵黄颗粒来源于线粒体、内质网、高尔基体、吞饮小泡等多种细胞器。     

Yolk mobilization in perch, Perca fluviatilis L., embryos

During embryogenesis of the perch, Perca fluviatilis L., a gradual proteolysis of yolk proteins was revealed by SDS-PAGE and immunoblotting and was comparable to other teleosts. A 118 kDa polypeptide was processed in two 96 and 18 kDa descendants; further proteolysis produced two peptides of 64 and 31 kDa. Ultrastructure and immunocytochemistry were used to compare electrophoresis patterns with morphological changes in the developing embryo and to localise yolk proteins in embryonic cell layers. In contrast to most other freshwater teleost, in spawned eggs of the perch yolk spheres fused together forming a homogenous yolk mass; lipid droplets formed a single oil drop on top of the egg. Combination of electrophoresis data and light and electron microscopical observations suggested a specific and parallel mobilization of yolk and lipid. In addition, yolk absorption by the yolk syncytial layer was observed. Numerous yolk platelets were found in the yolk syncytial layer and, in later stages of embryogenesis, also in the inner cell mass, but never in the cells of the enveloping layer.     

Cu2+对中间球海胆生长、免疫及性腺发育的影响

为探讨铜离子(Cu2+)对中间球海胆生长和性腺发育的影响及调控机制,在室内水槽(200 L)中进行为期60 d的浸泡实验。实验设置测试组(0.02 mg/L Cu2+)和对照组(自然海水),每个处理设置3个重复,每个水槽养殖20只海胆(13.58±0.79)g。实验中期和末期分别测定海胆增重率(WGR)、性腺指数(GI)、抗氧化酶活性和主要卵黄蛋白基因(MYP)表达量。结果显示,30 d时,测试组的WGR和GI与对照组差异不显著,而60 d时测试组的WGR和GI显著低于对照组;60 d时,测试组海胆体腔液中过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性均显著低于30 d时的对应值,而丙二醛(MDA)含量较30 d时有所升高;60 d时,测试组抗氧化能力总体高于对照组,其中体腔液中CAT活性显著高于对照组。2次取样中,测试组性腺中MYP基因的表达量均显著低于对照组,而测试组消化道中MYP基因的表达量却显著高于对照组。60 d时,测试组海胆体腔细胞中总蛋白含量显著高于对照组,而体腔液上清液中总蛋白含量在测试组和对照组之间差异不显著。研究表明,铜离子能够引起氧化应激,降低海胆的增重率和性腺指数,这可能是通过抑制性腺MYP表达量及阻碍MYP从消化道向性腺正常转运所致。     

家禽卵黄抗体作用机理及应用现状分析

卵黄抗体(IgY)来源廉价、特异性好、见效快,其作为一种理想的绿色饲料(食品)添加剂的应用正倍受关注。本文就其作用机理、产业化研究与应用现状、存在的问题进行了综述,并提出了建议,以加速其在畜牧养殖业和食品添加剂行业的推广应用。     

Changes in lipid classes,fatty acids,protein and amino acids during egg development and yolk‐sac larvae stage in brill (Scophthalmus rhombus L.)

Brill (Scophthalmus rhombus L.) is a flatfish considered of special interest for aquaculture diversification, but the high mortality observed during the early larval rearing is the main obstacle to commercial culture. The objective of this study was to contribute to the knowledge of nutrient utilization of early‐hatched larvae, characterizing the changes in lipid and protein contents during embryogenesis and the yolk‐sac larval stage of S. rhombus. Total lipid, lipid classes and fatty acid contents remained constant during embryogenesis and yolk‐sac larval development, except for phosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol, which increased in quantity during the yolk‐sac larval stage. On the other hand, total protein (including non‐protein nitrogen) and amino acids decreased their contents in both periods, especially at hatching. The decrease only in the serine, glutamic acid, proline and lysine contents during embryogenesis suggests a selective use of amino acids during this phase. Unlike embryogenesis, amino acids loss during hatching appears to be non‐selective, and almost all amino acids (essential and non‐essential) decreased. Our results suggest that there is higher catabolism of protein vs. lipid during embryogenesis and the yolk‐sac larval stage of S. rhombus.