缘管浒苔rbcL全长cDNA克隆与序列分析

对缘管浒苔光合作用第一关键酶Rubisco大亚基基因(rbcL)全长cDNA序列进行了克隆分离。首先应用RT-PCR方法获得了rbcL大片段cDNA序列,序列长度为1101bp,并进行了测序分析。然后分别应用5′RACE方法和3′RACE方法获得2个克隆序列,其序列长度分别为371bp和579bp,并进行了测序分析。在此基础上,将3个片段序列进行拼接,获得了Rubisco大亚基全长cDNA序列(1472bp),其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列(NCBI登录号:DQ813496),并推断出蛋白质序列(474个氨基酸)。对序列进行了相关生物信息分析和同源性比对,结果显示与已克隆出全长rbcL基因的7种绿藻比较具有较高同源性,核苷酸序列和蛋白质序列同源性分别达到了82.07%～85.78%和88.00%～94.11%,其中与蛋白核小球藻蛋白质序列同源性最高,为94.11%。在此基础上,使用生物信息学软件对缘管浒苔rbcL氨基酸序列与其它植物或藻类进行了多序列比对,并且进一步应用在线软件程序进行了蛋白质的二级结构分析和三级结构预测。     

小球藻psbA基因的克隆与序列分析

psbA基因编码光合系统II反应中心的D1蛋白,是叶绿体基因组中一个重要的光调控基因。对小球藻属4个种的6株小球藻psbA基因进行了PCR扩增和测序,并结合GenBank上已有的2条小球藻psbA基因序列,使用MEGA3.1软件对psbA序列进行了遗传距离值的计算和系统发育树的构建。结果显示8株小球藻psbA基因的遗传距离值为0.012~0.167。除了原始小球藻F-2和蛋白核小球藻820分别与蛋白核小球藻F-5、F-9及与普通小球藻Cvq关系极近之外,其他6株小球藻基本上按照种的划分进行聚类,该结果与用小球藻的ITS和rbcL序列分析的结果一致。     

小球藻核rDNA ITS与叶绿体rbcL基因序列分析及应用

用核基因组rDNA的内转录间隔区(ITS)和叶绿体rbcL基因对小球藻属((Jhlorella)6株小球藻的种间和种内关系进行了分析.克隆序列与GenBank数据库检索到的相关小球藻序列(ITS和rbcL序列各为15条)一起进行比较分析.结果显示:ITS序列长度在小球藻种内高度保守,在种间变异较大;而rbcL序列长度在种间和种内水平都高度保守.15株小球藻ITS序列间遗传距离在0.000～0.663.之间;而15株小球藻rbcL序列间距离在0.000～0.216之间.6株实验藻中原始小球藻F-2与蛋白核小球藻F-5、F-9近似种内关系;蛋白核小球藻820与普通小球藻Cvq亲缘关系极近;椭圆小球藻Ce与其它5株小球藻亲缘关系最远.研究表明将变异程度较高的核ITS序列与相对保守的叶绿体rbcL基因相结合可以用于小球藻系统发生分析和分子鉴定.     

缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的特性及在氮饥饿过程中相对转录量的分析

根据莱茵衣藻和普通小球藻ω3脂肪酸去饱和酶氨基酸序列(GenBank登录号分别为ABL09485和BAB78717)的保守区(TMFWALF和HHDIGTH)设计简并引物,以缺刻缘绿藻H4301总RNA为模板,通过反转录PCR和cDNA末端快速克隆技术(RACE),克隆了缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的cDNA全长序列(GenBank登录号:EU658930),它与莱茵衣藻的这个基因具有69%相似性。该基因cDNA序列长2330bp,其中5'-非翻译区长107bp;3'-非翻译区912bp,且具有明显的poly(A)尾巴;开放阅读框1311bp,编码一个436个氨基酸的蛋白质,分子量为49.06ku,等电点7.85;该基因编码的蛋白为膜结合蛋白,含有2个疏水区域和3个保守的组氨酸簇基序。将该基因的cDNA序列与其DNA序列比对后,发现该基因在其编码区存在6个内含子,剪切位点均符合GT-AG规则。实时荧光定量PCR结果显示,在氮饥饿培养过程中,缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的相对转录量在4h时可能因休克显著提高(P<0.05),然后开始下调,12h开始显著下降(P<0.05),并在20h降到最低(约为完全培...     

萼花臂尾轮虫非混交雌体SOX基因的克隆与分析

选用根据SOX基因蛋白序列设计的1对兼并引物,采用PCR技术扩增萼花壁尾轮虫(Brachionus calyciflorus)非混交雌体基因组DNA。结果显示:实验得到1个约220 bp的片段。经过克隆和测序分析,共获得2个有差异的DNA片段,其中一个DNA片段证明为萼花臂尾轮虫SOX2蛋白编码序列,与人和秀丽隐杆线虫(Cae-norhabditis elegans)DNA序列碱基组成相似性分别为68.98%和75.93%,其编码的氨基酸序列与人、秀丽隐杆线虫SOX2蛋白相似性分别为为84.72%和81.94%。另一个DNA片段长209 bp,用BLAST程序在GenBank数据库中搜索,没有找到相似性序列,用该序列推导氨基酸序列,发现两个终止密码子,推测该片段是受到自然选择作用失去功能的SOX基因。同时对多个物种的SOX2基因保守序列进行比对,发现萼花臂尾轮虫SOX2基因是一种古老的基因形式,具有高度的保守性。     

海带cbbX基因序列特征及在雌、雄配子体之间的差异表达

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,分子量为45.26ku,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,它们的剪切位点都遵循GT-AG规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有差异。自编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的Walker ATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列...     

翘嘴鳜生长激素cDNA克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列(收录号:AY155227)设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)脑垂体中克隆了生长激素基因(scGH)编码区序列并对其真核表达载体的构建进行了研究。结果显示:扩增片段全长615 bp,共编码204个氨基酸。该序列与GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列同源性为99.84%。将scGHcDNA序列定向插入pYES2/CT真核表达载体中,经过筛选、酶切和测序,证明重组子中确实插入了翘嘴鳜GH片段。     

04斜带石斑鱼干扰素调节因子 1 基因的克隆及其原核表达

对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的干扰素调节因子1(Interferon regulatory factor 1,IRF-1)基因进行了克隆、测序及原核表达.以PBS做对照,利用polvI:C刺激斜带石斑鱼,然后取其肝脏、头肾、脾脏提取总RNA,随机引物反转录获得cDNA.根据相近物种IRF-1的保守序列设计引物,通过PCR得到了保守片段,通过RACE-PCR获得了斜带石斑鱼IRF-1基因的全长cDNA.基因全长为1 730 hp,完整开放阅读框(ORF)906 bp,编码302个氨基酸,5'非编码区153 bp,3'非编码区671 bp.将斜带石斑鱼ORF与其他物种进行比对发现,与海鳜(Siniperca chuatsi)同源性最高,为85%.将根据斜带石斑鱼IRF-1 ORF推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现斜带石斑鱼与海鳜同源性为90%,与金头鲷(Sparus aurat)为88%,与乌鳢(Channa argus)为86%,与大菱鲆(Scophthalmus maximus)为82%.利用ORF序列,构建原核重组表达质粒.重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白成功表达,表达蛋白的分子量约55 kD.诱导温度为30℃时,重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体2种形式存在.     

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

三疣梭子蟹核受体基因HR38的克隆及其在蜕皮中的表达分析

采用RACE技术,克隆出三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)核受体基因HR38的c DNA全长,命名为PTHR38。该基因c DNA序列全长为2950 bp,5′和3′非编码区(UTR)长分别为101 bp和551 bp,开放阅读框(ORF)长2298 bp。推测编码765个氨基酸,预测分子量为84.2 k D,理论等电点为6.3。生物学分析预测,PTHR38基因编码的蛋白属于不稳定蛋白,不具有跨膜结构域。同源性分析表明,PTHR38基因编码的氨基酸序列与大型溞(Daphnia magna)的同源性最高。实时荧光定量分析表明,PTHR38基因在蜕皮周期的各个组织中均有差异表达,在眼柄中表达差异最大。去除单侧眼柄后,PTHR38的表达量在整体上呈现不同程度的上升趋势。     

坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的关键酶,目前已成为高等植物中研究最深入的酶之一,而在低等藻类中关于该酶的相关研究却很少。以来自浙江和福建的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系为研究对象,以江苏条斑紫菜(P.yezoensis)为参照,克隆了其Rubisco小亚基(rbcS)及大小亚基基因间隔区共516 bp的序列。序列分析结果表明,其中4个坛紫菜系(Hza、Hzf、Hpt、Hzz)的基因序列完全相同(以其作为标准),坛紫菜Hzb和Hzc与其均只有1个碱基差异,而条斑紫菜Yn55与其差别碱基为46个。将本实验的7条紫菜序列与GenBank数据库收录的17条紫菜Rubisco序列一起做系统分析,结果表明坛紫菜和条斑紫菜都分别归到了各自的类群中。以上结果说明,紫菜rbcS和rbcL-rbcS基因间隔区序列的同源性较高,可用于种以上水平的系统分析。     

奥利亚罗非鱼DMO cDNA的分离和克隆

采用RTPCR和RACE法分离和测定了奥利亚罗非鱼DMOcDNA的全序列。得到1571bp[不含poly(A)]的全长cDNA,包括148bp5’非翻译区,1230bp阅读框以及含Poly(A)信号AATAAA的193bp3’非翻译区[不包括Poly(A)]。阅读框共编码409氨基酸,与尼罗罗非鱼DMO编码的氨基酸序列进行比较,同源性为96.3%,表明DMO在同一物种中差别较小。而与尼罗罗非鱼,红鳍东方豚,虹鳟,青鱼将,鼠,人等动物的DMRT1编码的氨基酸序列进行比较,同源性分别为:25.7%,25.8%,24.3%,29.7%,22.5%,22.0%,这说明DMO和DMRT1可能是两个不同的基因。     

蓝太阳鱼生长激素全长cDNA的克隆与序列分析

The full length cDNA encoding growth hormone of a freshwater fish, Lepomis cyanellus, (LcGH) was cloned from pituitary RNA with RT-PCR, 3‘ and 5‘ RACE (rapid amplification of cDNA ends). The LcGH cDNA (Genbank No. AY530822), about 989nt (nucleotide) long, consisted of a open reading frame with 615nt long, 5‘and 3‘untranslated regions with 93nt and 224nt long respectively, and a 57nt poly (A) tail. The DNA sequence analysis showed that there are typical Kozak sequence and polyadenylation signal. The pregrowth hormone peptide of 204aa deduced from LcGH cDNA included a putative signal peptide (17aa) locating in its Nterminal. There exist a Asn-Cys-Thr glycosylation site at amino acid 201, and 4 cysteine residues (No. 69, 177, 194, 202) that are essential to construct two S-S bonds in this pregrowth hormone peptide. Homological comparision among LcGH and other species growth hormones showed that There is high homology (more than 85%) between growth hormone of Lepomis cyanellus and that of most perciformes fish, but low homology (less than 70%) in comparison with other species such as Siluriformes and Cypriniformes fish.     

鲢鱼恒定链cDNA的克隆及其分子结构分析

为研究鱼类恒定链(Invariant chain,Ii)的结构与功能,应用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNAends)法,从脾脏细胞中克隆了鲢(Aristichthys molitrix)Ii基因cDNA,并进行了测序。该基因cDNA全长为1 136bp,其中开放阅读框为699 bp,编码232个氨基酸。比对氨基酸序列发现,鲢与其他物种的Ii链有相同的结构域。将Ii基因cDNA片段和表达不同结构域的DNA片段分别插入真核表达质粒pEGFP-C1,转染真核细胞系COS7,发现鲢Ii跨膜区和胞浆区在细胞内具有定位作用。根据推测的氨基酸序列,分析不同种间Ii的同源性,表明鲢与斑马鱼(Brachydanio rerio)的同源性最高(78%),与人等哺乳动物Ii的同源性较低(30%～40%)。进一步模拟构建和比较不同物种Ii链的3D结构,显示链鱼和小鼠、人和鸡的Ii链结构非常相似,甚至在一些具有重要作用的氨基酸是相同的。上述结果表明,作为重要的免疫分子,不同脊椎动物的Ii链不仅在遗传上具有高度同源性,而且在结构方面仍保持着高度的相似性。     

剑尾鱼 2 种卵黄蛋白原全长 cDNA 的克隆及序列分析

卵黄蛋白原是环境雌激素效应研究的重要生物标志物,广泛应用于水环境内分泌干扰物污染的评价。本研究利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆获得了剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的2种卵黄蛋白原基因—VgA和VgB,并对其基因结构和系统进化进行分析。VgA基因cDNA序列全长5159bp,开放阅读框(ORF)5058bp,编码1685个氨基酸。VgB基因cDNA序列全长5349bp,开放阅读框(ORF)5067bp,编码1688个氨基酸。2种cDNA序列均具有与已发现的卵黄蛋白原分子相似的主要特征和功能域,包括Vitellogenin结构域、VWFD结构域和多聚丝氨酸区域,且与已知其他鱼类卵黄蛋白原基因有较高的同源性。     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540)；PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

Cloning, tissue distribution and hormonal regulation of stearoyl-CoA desaturase in tilapia, Oreochromis mossambicus

The stearoyl-CoA desaturase cDNA in tilapia (Oreochromis mossambicus) was cloned by RT-PCR and RACE, and it was compared with those in grass carp, common carp and milkfish. Nucleotide sequence analysis revealed that the full length of cDNA (1172 bp) clone encompasses 1008 bp open reading frame (ORF) encoding 336 amino acid residues. The deduced amino acid sequence shares 78–82% identity with the teleosts and 64–66% with mammals compared, and like these fish, the cloned tilapia stearoyl-CoA desaturase amino acid sequence conserves three histidine cluster motifs (one HXXXXH and two HXXHH), which functioned as non-heme iron binding sites, essential for stearoyl-CoA desaturase activity. RT-PCR and Northern blot analysis reveal that tilapia stearoyl-CoA desaturase is expressed only in liver, but the stearoyl-CoA desaturase expression in multiple tissues was observed in milkfish, grass carp and carp. Further, the hormonal regulation of stearoyl-CoA desaturase gene expression was investigated by a single injection of 17β-estradiol and testosterone. The results showed that the administration of 17β-estradiol to tilapia led to a greater increase in desaturase activity than testosterone, and higher doses of steroids produced greater increases in enzyme activity. The comparative RT-PCR analysis showed that the stearoyl-CoA desaturase mRNA level increased significantly in 17β-estradiol treated animals, especially in the groups receiving a single injection of 50 mg 17β-estradiol. This was reflected in the decrease in the saturated fatty acids and the increase in the monounsaturated fatty acids. The proportion of the polyunsaturated fatty acids was not affected.     

Occurrence of two distinct molecular species of cathepsin B in carp Cyprinus carpio

ABSTRACT:   We purified cathepsins B₁ and B₂ from the ordinary muscle of carp Cyprinus carpio . The N-terminal amino acid sequences (12 residues) of 29 kDa bands of cathepsins B₁ and B₂ are the same and showed high homology of 75% and 83%, respectively, with the heavy chain of rat and human cathepsins B. Based on conserved sequences of other cathepsins B and the N-terminal amino acid sequences of 29 kDa bands, we cloned carp cathepsin B cDNA. The nucleotide sequence of carp cathepsin B cDNA consists of 1470 bp including a 993 bp open reading frame, encoding a deduced protein of 330 amino acids. The deduced amino acid sequence of carp cathepsin B has similarity of 80% to rainbow trout cathepsin B and of 76–78% to other vertebrate cathepsins B. The sequence of its isoform was also determined during molecular cloning, which has 94.8% similarity with first cloned cathepsin B. They are completely same in N-terminal amino acid sequence of heavy chain, active site and potential N-glycosylation site. This indicates there are at least two kinds of cathepsin B functioning in vivo in carp.