中国大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)PCR检测方法的建立及其应用

大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一.本研究提取了该病毒DNA,依据其主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物,优化了PCR反应参数,建立了TRBIV的PCR检测方法,测试了该方法的特异性和灵敏度,并应用该方法开展了TRBIV的流行情况调查及研究了大菱鲆的外观症状(红体)与TRBIV感染的关系.结果显示,本研究建立的TRBIV PCR检测方法可以从相当于100ng病鱼组织中或103数量级的病毒粒子中检出TRBIV,也可以在不杀死被测鱼的情况下,仅从鱼体中抽取少量血液即可在1天的时间内完成大量样品的TRBIV检测,但不能从健康大菱鲆脾组织和患淋巴囊肿牙鲆的囊肿组织中扩增出任何产物,说明该方法具有很高的灵敏性和特异性;在所调查的山东半岛5家大菱鲆养殖场的19尾大菱鲆中,7尾为TRBIV阳性或弱阳性;具有"红体"症状的大菱鲆应当划分为"病毒性红体病"、"细菌性红体病"和"非病原性红体症"3种不同的类型.本研究为TRBIV的流行情况和传播途径调查、疾病的快速诊断和控制提供了技术手段;调查结果显示TRBIV已遍布山东半岛沿海地区的大菱鲆主产区,在地域上相距较远的多个大菱鲆养殖场流行,今后需要密切关注该病毒的传播和流行.     

海水养殖鱼类中虹彩病毒无症状感染的套式 PCR 分析

大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国和韩国养殖大菱鲆的主要病毒性病原.本研究依据TRBIV的腺苷三磷酸酶(Adenosine triphosphatease,ATPase)基因序列,设计了特异性的引物,建立了一种检测TRBIV的套式PCR方法,该方法检测TRBIV的灵敏度大约为一步PCR的104倍.应用该方法对6种中国常见海水养殖鱼类进行TRBIV感染情况调查,在无明显发病症状的黑鮶(Sebastodes fuscescerns)、宽体舌鳎(Cynoglossus robustus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)和非洲黑石斑鱼(Alphestes afer)4种鱼类中,扩增出长度约为471 bp的特异性DNA片段.对这些来自于不同鱼类的DNA片段进行测序和序列比对后发现,它们之间完全相同,且与TRBIV的ATPase基因序列有100%的同源性.研究结果表明,在这4种海水养殖鱼类体内存在TRBIV的无症状感染,它们可能也是TRBIV的宿主.     

中国大菱鲆虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的PCR扩增及序列分析

应用同源PCR技术，从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆（Scophthalmus maximus）脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620bp的DNA片断。序列测定和Blast分析表明，该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）C末端编码区的DNA序列高度相似，由此证实感染养殖大菱鲆的这种球状病毒为一种鱼类虹彩病毒，暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）。多序列比对和分析发现，TRBIV MCP C末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒相应序列的相似性分别为99．47％（韩国大菱鲆虹彩病毒）、97％～98％（待指定病毒属的7种病毒），以及50％以下（蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、虹彩病毒属的12种病毒），由此绘制出了包含TRBIV在内的21种虹彩病毒的系统发育树。研究结果表明，感染中国养殖大菱鲆的TRBIV属于虹彩病毒科待指定病毒属，位于该属ISKNV亚群和RSIV亚群之间，是该病毒属的一个新成员。     

大菱鲆病毒性红体病及其综合防治的研究

近几年来大菱鲆养殖疾病日益严重，已严重威胁到该产业的健康发展。其中，病毒性疾病危害尤甚，现将大菱鲆病毒性红体病的致病病原、临床症状、流行及对大菱鲆养殖的危害等有关情况报告如下，在此基础上重点结合作者对海水鱼类病害研究，对该病的预防提出几点建议，供广大大菱鲆养殖者参考借鉴。     

大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的重组分泌表达

依据大菱鲆红体病虹彩病毒（Turbot viral reddish body iridovirus，TRBIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）基因序列，设计了一对特异性引物，并在正反向引物中分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点，从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点，并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切以及测序分析，构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MCP经Avr Ⅱ单酶切后电转导入毕赤酵母X-33中，挑选阳性克隆，提取表达上清经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹分析。结果显示，TRBIV MCP基因在酵母中成功实现分泌表达。阳性重组酵母菌经过72h诱导培养后，重组TRBIV MCP的表达量高达60.2μg/ml左右。     

一种虹彩病毒感染大菱鲆的病理学研究

对我国虹彩病毒感染的大菱鲆Scophthalmus maximus进行的组织病理和超微病理学研究发现,该病典型的病理学特点是在病鱼的脾脏、肾脏、肠、肝脏、鳃、心脏和皮肤等器官组织内出现嗜碱性的肿大细胞。病毒感染导致患病大菱鲆多个器官组织发生了不同程度的病理变化,其中以脾脏组织的病理变化最为显著,表现为造血组织的严重坏死。此外,肾脏造血组织发生坏死、肠固有膜和黏膜下层出血和水肿、肝细胞水样变性、心肌局灶性坏死以及皮肤真皮层出血并伴有水肿和炎性渗出也是该病常见的组织病理学变化。超微病理研究表明,肿大细胞内有虹彩病毒粒子存在。病毒分布于受感染细胞的胞质、组织间隙以及血管腔内。受感染细胞出现线粒体和内质网等细胞器肿胀、崩解等细胞病理变化。研究认为,病毒感染造成皮下组织血管损伤出血,是虹彩病毒感染的大菱鲆发生＂红体病＂的原因所在。虹彩病毒感染所致的机体严重贫血是患病大菱鲆死亡的主要原因,而主要器官组织的病变使得病鱼器官功能衰竭则可加速鱼的死亡。     

养殖大菱鲆烂鳍病的流行调查及人工感染试验

通过现场调查和记录备案送检大菱鲆病鱼样品的方法,对我国大菱鲆主要养殖区烂鳍病进行了21个月流行情况调查,共采集到烂鳍病发病样品20个。调查结果发现,烂鳍病是大菱鲆养殖比较常见的细菌性疾病之一,自然高发期集中于5~8月水温较高的时期,苗期的大菱鲆最易感染,发病鱼一般都是急性死亡。组织病理学的研究显示,病鱼多个组织器官均发生不同程度的病变。用该病致病菌对苗期大菱鲆进行的人工感染试验结果表明,高浓度的病原菌对大菱鲆的致病力是相当强的。根据感染试验死亡曲线推算出该致病菌对大菱鲆半致死量为5.9×103cfu/m l。     

大菱鲆“红嘴病”病原分离及药物防治技术研究

2008年5月在河北、辽宁部分大菱鲆养殖场相继发生了养殖大菱鲆"红嘴病",并造成较大伤亡.该病主要危害50～150 g鱼种,主要症状表现为:病鱼吻端及腹面上颌出血,部分鱼鳃盖有出血的溃烂小凹洞,口腔内出血,部分病鱼眼睛肿大突出、挑破外膜内有大量脓液,肠道充血无食物,肠道末端有少量粘稠液体,肝脏充血、色暗淡呈糜散状,脾脏肿大发红.对该病的病原进行了分离并进行了药物防治实验.     

红鳍东方鱿的病害防治

1 病毒性疾病（白口病） 该病是病毒感染症，流行于高温期，病鱼以1龄以下的鱼为主，可造成鱼群大量死亡，是红鳍东方纯养殖中最主要的疾病。     

真鲷虹彩病毒引起养殖斑石鲷大规模死亡的研究

2017年8月，山东省烟台市某养殖场网箱养殖的斑石鲷(Oplegnathus punctatus)幼鱼突然发病并大量急性死亡。疾病调查显示，养殖海域水温为26℃~28℃；病鱼为4~5月龄，全长为(16.3± 1.6) cm，体重为(156.9±37.0) g；80万尾斑石鲷幼鱼2周内累积死亡率达90%以上，经济损失惨重。临诊检查发现，病鱼体表无明显损伤，但活力差、呼吸急促。剖检可见病鱼脾肿大、质地脆、易碎，肾糜烂，肝有出血点。组织切片观察发现，病鱼脾、肾造血组织中可见许多直径约为20 μm的肿大细胞，肿大细胞内含有大量直径约为145 nm、呈六边形的病毒颗粒。用过滤除菌的病鱼脾组织匀浆液，腹腔注射感染健康斑石鲷，感染组14 d内累积死亡率达95%。人工感染病鱼表现出与自然发病鱼类似的外观症状，且在脾、肾组织切片中也可观察到大量的肿大细胞及相似的病毒粒子。使用特异性PCR引物，从自然发病鱼和人工感染病鱼的肝、脾和肾组织中均检测到鱼类虹彩病毒的高强度感染。克隆、测序得到了1362 bp的病毒主要衣壳蛋白基因(MCP)，序列比对显示，该病毒的MCP序列与真鲷虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相应序列完全相同。构建的虹彩病毒系统发育树也显示，该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群，是RSIV的一个分离株。本研究首次证实RSIV可以导致斑石鲷大规模死亡，研究结果为诊断和防治斑石鲷病毒病提供了重要参考。     

大菱鲆工厂化养殖试验

2001年4月22日－2002年4月22日的实验结果表明，大菱鲆工厂化养殖应选择水温为7－24℃的水源，最好控制在13－18℃之间，PH值大于7，盐度高于15，水循环量6－8个，在上述条件下，其生长速度为1龄期间1mm/d左右，养殖12个月后体重平均可达700g左右，密度15－20尾／m^2，成活率93．7％，湿性颗粒饵料系数1．83，随着个体长大，雌、雄个体出现明显差异，水温13－18℃时，摄食量变化不明显；9－13℃时，摄食量随水温降低而减少，投饵量视鱼体大小和摄食状况而定。     

饲料Vc对大菱鲆非特异性免疫力的影响

X用维生素C（Vc）含量为0～2500mg／kg的配合饲料连续投喂大菱鲆70d后，测定大菱鲆血液白细胞的总数、吞噬活性、血清溶菌酶活性和总补体活性。结果表明，饲料中Vc含量增加到250mg／kg，白细胞总数明显增加，进一步提高Vc含量，白细胞总数没有显著变化；血清溶菌酶活性在Vc含量为250mg／kg时最高，其他各组无显著性差异；添加Vc的各试验组的总补体活性明显地高于对照组，但是添加Vc的各组之间的总补体活性没有显著性差别；Vc含量对白细胞的吞噬活性没有影响。     

Growth and the effect of grading, of turbot in a shallow raceway system

Juvenile turbot Scophthalmus maximus (L.), ranging in size from 30 to 407 g were graded into small, large, and unsorted groups in a low-water-level raceway system. Water depth was 7 cm. The rearing design proved self-cleaning and well suited for turbot ongrowing. Mean initial weights 146.2, 236.1, 162.7 g increased to 299.1, 465.6 and 343.1 g in the small, large, and unsorted groups respectively during the 86 day experiment. The corresponding SGRs were 0.84, 0.79 and 0.87% day-1. No positive effect of grading on biomass production was revealed. The coefficient of variance gave no indication of social interactions, but plotting the start weights against estimated individuals SGRs did, although the effect was minor.     

养殖大菱鲆使用甲醛残留状况研究

试验针对工厂化养殖大菱鲆大量使用甲醛的现状,研究使用甲醛后对大菱鲆食用安全性的影响。主要通过测定用药后不同时间大菱鲆体内的甲醛残留量,探索甲醛在大菱鲆可食部分中的残留状况。研究发现,用药初期甲醛在大菱鲆体内会有一定量残留,但随时间延长残留量不断下降,在一定时间后大菱鲆可食部分甲醛残留量可以达到未检出水平。试验结果提示,大菱鲆工厂化养殖规范化使用甲醛,在第8天可以达到未检出水平,不会影响产品可食部分。     

镉在大菱鲆体内蓄积规律及对生长和食品安全影响初探

采用鱿鱼、头足类及其加工下脚料等高含镉原料配制饲料喂养大菱鲆亲鱼，发现诱食效果较好、鱼体增重较快，但一年后出现死亡率增高的现象。经解剖观察，死鱼的肝、肾、胰腺、胆等均有不同的病变现象。研究镉在其体内蓄积规律，发现镉在鱼的肌肉、肝脏、肾脏中的含量分别是饲喂普通饲料养殖大菱鲆的4～9倍、6～9倍和5～10倍，且死鱼的镉含量高于活鱼；镉在鱼肝脏和肾脏中的含量分别是肌肉中的100-400倍，是主要的蓄积器官和靶器官。高含镉饲料可能对养殖大菱鲆健康生长和食品安全卫生造成严重影响。     

不同溶解氧条件下亚硝酸盐和非离子氨对大菱鲆的急性毒性效应

研究了过饱和氧条件下亚硝酸盐和氨氮对大菱鲆急性毒性效应,同时对比了在正常溶解氧条件下亚硝酸盐和氨氮对大菱鲆急性毒性效应。实验结果表明,过饱和氧条件下亚硝酸盐对大菱鲆的48hLC50值和96hLC50值(95%可信限)分别为467.60mg/L和390.78mg/L,非离子氨对大菱鲆的48hLC50值和96hLC50值(95%可信限)分别为2.40mg/L和1.73mg/L;而正常溶氧条件下,亚硝酸盐对大菱鲆的48hLC50值和96hLC50值(95%可信限)分别为181.07mg/L和130.66mg/L,非离子氨对大菱鲆的48hLC50值和96hLC50值(95%可信限)分别为1.82mg/L和1.14mg/L。亚硝酸盐和非离子氨对大菱鲆均具有一定的毒性,其主要中毒症状表现为,中毒的个体开始急躁不安并沿槽壁狂游,频繁发生相互碰撞或与槽壁摩擦,随后行动减缓并伴有侧游或侧翻动作,呼吸速度减慢,发生昏迷并沉落水底,直至死亡。死亡的大菱鲆鱼体弯曲,体色变淡,鳃盖张开。无论在过饱和氧还是在正常溶氧条件下非离子氨对大菱鲆的毒性都远大于亚硝酸盐的毒性,同时高浓度溶解氧的存在使大菱鲆对这两种毒物的耐受能力得以提高。提出了在大菱鲆循环水养殖过程中可以通过向水体充氧的方式以提高大菱鲆对亚硝酸盐和非离子氨的耐受力。     

大菱鲆正常代谢水平及节律性的研究

对工厂化养殖的不同规格大菱鲆(Scophamus maximus Linnaeus)的日常代谢进行了研究。结果表明,4种规格的大菱鲆表现出相同的代谢规律性,摄食对大菱鲆的代谢有明显的影响,摄食后代谢率呈迅速上升的趋势。在摄食后3～9 h内代谢率出现第1高峰值,在凌晨3:00～6:00(摄食后21-24 h)出现第2高峰值,代谢率昼、夜之间的差异不显著(P>0.05)。体重对大菱鲆的代谢有着显著的影响,4种规格9.69±3.35g、33.34±8.34g、130.18±26.75g和264.11±35.79g的大菱鲆日平均耗氧率分别为0.2702±0.0225、0.1880±0.0189、0.1592±0.0436、0.1033±0.0184mgO2/g·h,日平均氨氮排泄率分别是0.6496±0.0303、0.4560±0.0669、0.3744±0.0320、0.2831±0.0662mgN/100g·h,随着体重的增加,单位体重的代谢率呈下降的趋势(P<0.05)。     

Effects of size grading on growth and survival of juvenile turbot at two temperatures

Juvenile turbot were size graded into three size groups (mean initial size): Small (3.4 g), medium (7.0 g) and large (10.5 g), and additional fish were held in ungraded (6.6 g) groups. Subgroups (n = 396) of fish were tagged and individual growth rates and social interactions within different size categories were studied in fish reared at 13 and 19 °C. Size grading of juvenile turbot did not improve growth. Specific growth rates (SGR) were mainly size-related, and no differences in SGR or mortality between the experimental groups at both tem-peratures were found. A higher level of social interactions was indicated amongst medium-sized fish than amongst those in the smallest and largest categories. Excess feeding may have been important factors in reducing aggression, so that the growth of the smallest individuals was not suppressed by the larger individuals in the present study. Grading seems to be an unnecessary operation to improve the growth and survival of juvenile turbot (5- 150 g). However, as it was mainly the smallest individuals in each group that died, grading of very small turbot (2-5 g) can be recommended.     

维生素E及脂肪源对大菱鲆非特异性免疫的影响

在大菱鲆饲料中分别添加鲤鱼鱼油及花生油作脂肪源，每种脂肪中添加两个水平的维生素E（8mg／kg和300mg／kg维生素E醋酸酯），饲养大菱鲆84d，探讨其对大菱鲆非特异性免疫的影响。结果发现，（1）以鲤鱼鱼油为脂肪源的添加高剂量的维生素E能提高大菱鲆血清补体活性，而以花生油为脂肪源的饲料添加高剂量的维生素E不影响大菱鲆血清补体活性；（2）以鲤鱼鱼油和花生油为脂肪源的饲料添加高剂量的维生素E不影响大菱鲆中性粒细胞的吞噬率及白细胞总数；（3）以鲤鱼鱼油为脂肪源的饲料添加高剂量的维生素E能提高大菱鲆的溶茵酶活性，但随着时间推移其影响减弱；（4）饲喂n-3HUFA含量高的饲料，对大菱鲆腹水病的抵抗能力高于n-3HUFA含量低的饲料。     

应用高通量测序技术分析大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境的微生物群落结构

采用基于Illumina测序平台的高通量测序技术,对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼肠道及其养殖水体、生物饵料中细菌种类及丰度进行研究。测序结果显示,养殖水体、生物饵料和大菱鲆幼鱼肠道等19个样品共获得有效序列547621条,可聚类于3771个可分类操作单元(OTUs),归属于养殖水体、生物饵料、健康幼鱼和发病幼鱼的操作分类单元(OTU)个数分别为3038、1090、87和777,其中,健康幼鱼与生物饵料、健康幼鱼与养殖水体特有的OTU个数分别为57和0,发病幼鱼与生物饵料、发病幼鱼与养殖水体特有的OTU个数分别为481和31。表明幼鱼肠道微生物多样性与生物饵料密切相关。根据细菌注释结果,拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在大菱鲆幼鱼肠道中占优势地位,其中,健康幼鱼肠道微生物共聚类为8个门,发病幼鱼的肠道微生物可聚类为19个门。与健康幼鱼相比,发病幼鱼肠道门水平上的3种主要优势菌群落结构出现失衡。此外,对各样品中丰度最高的100位OTU分析显示,幼鱼肠道优势菌种类与生物饵料中的优势菌种类密切相关,而每个发病幼鱼肠道优势菌种类具有一定的独立性。本研究旨在为大菱鲆健康养殖和微生态调控提供实验依据。