山东近海习见鱼类DNA条形码及其电子芯片分析

从GenBank下载到13目50科73属77种山东近海鱼类的线粒体细胞色素c氧化酶I(CO I)序列,通过分析其遗传距离及系统进化,并基于CO I序列筛选物种特异性探针来分析DNA芯片技术在进行物种鉴定时的可行性。结果表明,在CO I基因DNA条形码的分析中,77种鱼类的种间遗传距离(平均0.117)明显大于种内遗传距离(平均0.0034),且每个物种的不同个体在进化树上都能聚在一起,提示DNA条形码能全部区分77个物种;根据CO I基因设计的用于芯片的特异性探针中,77个物种最终有64个可以筛选出物种特异性探针,占总物种数的83.1%,本研究旨在为山东近海鱼类物种鉴定提供了技术支持。     

长江中游常见鱼类DNA条形码研究及其电子芯片分析

为建立长江中游常见鱼类的快速鉴别方法,文献调研了7目11科50属64种鱼类名录,GenBank共获取168条线粒体细胞色素c氧化酶I (COⅠ)序列,分析了序列特征、不同阶元Kimura-2-paramater(K2P)遗传距离及系统进化关系。结果显示,64种鱼类的种间遗传距离(平均值为0.084)明显大于种内(平均值为0.0079),NJ树上不同物种均能以较高支持度聚类成独立分支,以线粒体COⅠ序列作为DNA条形码可准确鉴定所研究鱼类;综合利用分子生物学软件筛选物种特异性探针,最终43种鱼类可筛选出112条物种特异性探针,物种识别率为67.2%。本研究验证了DNA条形码芯片技术在长江中游鱼类物种鉴定的可行性,可为该地区鱼类物种多样性保护提供技术支持。     

鲹科鱼类DNA条形码分类系统

为了验证 DNA 条形码在鲹科(Carangidae)鱼类物种鉴定和系统分类中的适用性, 本研究自测 6 属 7 种 17 条序列, 同时筛选了 BOLD 数据库中的有效序列, 共获得 25 属 95 种 273 条鲹科鱼类 DNA 条形码序列, 通过 BLAST 比对、遗传距离和系统关系树, 构建了鲹科鱼类的 DNA 条形码分类系统。结果表明: (1)鲹科鱼类属间、种间、属内种间和种内三级分类单元遗传距离的平均水平分别为 0.186、0.169、0.090 和 0.008, 种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的 21 倍, 可见 DNA 条形码适用于鲹科鱼类分类鉴定; (2)运用 DNA 条形码技术可以识别出形态鉴定有误的物种, 表明 DNA 条形码可以弥补传统形态学鉴定的局限性, 可对鲹科鱼类形态学分类结果进行精准修正; (3)鲹科鱼类 DNA 条形码分析表明, BOLD 数据库中仍存在一定的“同种异名”和“异种同名”现象, 建议使用该数据库信息时应严格评估信息的准确性; (4)鲹科鱼类系统发生关系研究对物种的分类地位提出了新的见解, 即拟鲳鲹 (Parona signata)和镰鳍波线鲹(Lichia amia)亲缘关系较近, 支持将二者均归为鲳鲹亚科(Trachinotinae)。本研究旨在为丰富鲹科鱼类 DNA 条形码数据, 完善鲹科 DNA 条形码分类系统, 并为鲹科鱼类物种鉴定和系统分类提供分子证据。     

鲉形目鱼类DNA条形码分析及鲉科DNA条形码电子芯片建立

为建立鲉形目内各物种的快速鉴别方法,本研究扩增了我国47个鲉形目物种并下载了Gen Bank上收录的鲉形目共计23科85属233种873条细胞色素C氧化酶I基因(COI)序列,分析该基因结构特性。结果表明,鲉形目DNA条形码基因的碱基变异中,不变位点508个,占总位点数的82.1%;转换位点70个,颠换位点41个,分别占总位点数的11.3%和6.6%;种内遗传距离为0~0.019,平均遗传距离为0.003?0.0034;属内种间遗传距离为0.003~0.258,平均值为0.086?0.038;基于233个物种的COI序列构建的系统进化树显示,227个物种(97.4%)能聚为独立分支,且具有较高支持度。在此基础上以鲉科11属39种鱼类的DNA条形码为例,筛选出25个种的37个特异性探针,以此探针对鲉科鱼类进行物种快速鉴定成功率为64.1%,研究结果表明DNA条形码芯片用于鲉科的鉴定具有一定的可行性。     

DNA条形码在篮子鱼科鱼类种类鉴定和系统进化分析中的应用

为建立篮子鱼科鱼类物种快速鉴定方法,该研究扩增获得了篮子鱼科10种鱼类的46条线粒体COⅠ基因序列,结合从BOLD和GenBank上筛选出的12种27条篮子鱼科COⅠ基因序列,分析篮子鱼科鱼类的COⅠ基因片段序列特征、种间和种内遗传距离及分子系统进化关系。结果表明,19种73条篮子鱼科COⅠ基因序列的平均碱基组成为T:28.9%、C:28.7%、A:24.6%、G:17.8%。G+C的含量(46.5%)低于A+T的含量(53.5%),碱基组成表现出明显的偏倚性;篮子鱼科鱼类的种间平均遗传距离为0.098,是种内平均遗传距离(0.002)的49倍;基于19种篮子鱼科鱼类的COⅠ序列的系统进化分析结果显示,19种篮子鱼中仅单斑篮子鱼(Siganus unimaculatus)和狐篮子鱼(S. vulpinus)聚类在一起,形成1个分支,剩余17种(89.5%)篮子鱼相同种内个体各自聚为一支,形成17个独立的分支。结果表明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可应用于篮子鱼科物种鉴定。     

鲿科鱼类DNA条形码鉴定及系统进化研究

鲿科鱼类是一类高度多样化的类群,一些具有高度相似特征的物种难以通过形态进行识别,系统分类关系混乱,因此,选择一种更为有效、便捷的鱼类鉴定和分类方法十分必要。对5属36种共214条鲿科鱼类线粒体COⅠ基因序列进行分析,结果表明:36种鲿科鱼类的种内和种间平均遗传距离分别为0.016和0.158,种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的9.875倍;大多数鲿科鱼类的种内遗传距离小于种间遗传距离,在种内、种间重叠较少,能形成的一定的DNA条形码间隙。ABGD结果将36个物种定义为25个运算分类单元,运算分类单元的划分与距离法结果大体一致,种间遗传距离较小的物种被划分为同一个运算分类单元,种内遗传距离较大的物种分化为多个运算分类单元。聚类树结果显示:黄颡鱼属、拟鲿属和■属的鱼类聚成一大支;鳠属和半鲿属中各有1个物种聚类到对方的分支中,这两属之间存在不完全的谱系分选。在本研究中,DNA条形码在大部分鲿科鱼类中能进行有效的鉴定,但对一些近缘种,条形码鉴定存在局限性,同时,COⅠ条形码也阐明了鲿科鱼类的系统进化关系,可为鲿科物种的系统分类提供科学依据。     

黄渤海虾虎鱼DNA条形码分类体系构建

虾虎鱼(Gobiidae)是海洋底层食物链中的关键环节, 在生态系统的物质循环和能量流动中发挥重要作用。因虾虎鱼种类繁多、分布广泛、体型较小, 加之形态上存在不同程度的特化, 对形态学分类鉴定带来极大挑战。本研究对采自黄渤海的 73 尾虾虎鱼成鱼和幼鱼样本分别进行了形态学鉴定和 DNA 条形码分析, 依据形态学分类特征, 鉴定出 9 属 12 种; 而运用 DNA 条形码技术, 共鉴定出 13 种, 隶属于虾虎鱼科 10 属。可见, 在形态学鉴定经验不足或幼鱼形态学特征不明显的情况下, DNA 条形码可以有效地实现物种鉴定。同时, 系统整理了黄渤海虾虎鱼科记录种名录, 共计 29 属 47 种。依据物种名录, 从 BOLD 及 NCBI 数据库中筛选并下载了 18 属 29 种虾虎鱼科鱼类的 DNA 条形码, 与本研究鉴定出的 10 属 13 种虾虎鱼类合并分析, 构建了虾虎鱼科 26 属 42 种鱼类的系统关系树, 覆盖了黄渤海虾虎鱼科 89.36%的记录种, 通过对虾虎鱼科鱼类的分子系统发育关系与形态学分类地位进行确认和修订, 初步建立了黄渤海虾虎鱼科 DNA 条形码分类体系。本研究结果证明了 DNA 条形码技术对虾虎鱼物种具有较高识别效率, 有效弥补了传统形态学鉴定方法的缺点和局限, 丰富了虾虎鱼 DNA 条形码数据库, 完善了虾虎鱼 DNA 条形码分类体系, 为虾虎鱼的保护生物学、进化生物学及生物地理学等研究提供了科学依据。     

南极鱼亚目鱼类DNA条形码及分子系统学

以南极海域“南极海洋生物资源养护委员会”(the Commission for the Conservation Antarctic Marine Living Resources, 简称 CCAMLR) 48.1、48.2 和 48.3 亚区的南极磷虾(Euphausia superba)渔业兼捕所得 97 份南极鱼样品为研究对象, 经形态学特征分析和 DNA 条形码将其鉴定为南极鱼亚目 4 科 17 属 17 个有效种, 其中依据形态学特征只鉴定出 6 个物种, 其余 11 个物种则依据 DNA 条形码得到准确鉴定。可见, 在形态学鉴定经验不足或样品形态不完整的情况下, DNA 条形码可以有效的实现物种鉴定。继而, 分析了南极鱼类 97 条 DNA 条形码的碱基组成特征, 发现 GC 含量第一密码子最高且第二密码子最低可能为南极鱼亚目类群的特有现象, 但其生物学意义尚有待于进一步研究。将本研究采集的南极鱼亚目 17 种鱼类与 BOLD 筛选的 64 种鱼类的 DNA 条形码合并, 构建了南极鱼亚目 4 科 39 属 81 种鱼类的系统关系树, 这是迄今为止包含种类最多的南极鱼亚目鱼类分子鉴别和系统进化关系分析。遗传距离和系统关系树分析进一步证明 DNA 条形码对于南极鱼类物种鉴定的适用性与可行性, 另外还发现南极鱼亚目鱼类的个别物种其分子系统关系与形态学分类地位不一致。本研究结果证实了 DNA 条形码技术对南极鱼亚目分类群的识别效率, 弥补了传统形态学鉴定方法的局限和不足, 丰富了南极鱼类 DNA 条形码数据库, 为南大洋鱼类多样性与适应性进化研究奠定基础, 同时为南极渔业资源保护和可持续开发利用提供科学依据。     

鱼类DNA条形码技术的应用进展

<正>基于DNA序列进行物种鉴定的DNA条形码技术自2003年问世以来,经过十几年的快速发展,不仅在各种动植物的物种鉴定方面取得巨大成就,而且在动植物区系、生态和物种保护、生物安全、食品安全等方面得到越来越多的应用,并取得一系列成果。鱼类是最具多样性的脊椎动物,全球预计有多达40000种鱼类[1]。由于在发展过程中具有高度的多样性,传统的鱼类物种鉴定方法存在很多问题。DNA条形码在鱼类物种鉴定中最早获得应     

鳅科鱼类DNA条形码分析及泥鳅和大鳞副泥鳅的分子鉴定

采集了23种鳅科鱼类89尾个体的线粒体COI基因5端序列,分析了碱基组成以及不同鳅科鱼类之间的种间遗传距离和种内遗传距离。结果显示,鳅科鱼类的种间遗传距离显著大于种内遗传距离,表明以COI作为鳅科鱼类DNA条形码进行品种鉴定具有一定的可行性。在建立鳅科鱼类DNA条形码的基础上,设计了主要物种泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)特异性引物,结果显示,该引物具有较高的特异性和灵敏度,能够实现对泥鳅、大鳞副泥鳅及其混合样品的物种鉴定。     

利用DNA条形码COI基因分析我国重要贝类系统进化关系

DNA条形码旨在通过PCR技术获得一段DNA序列,在物种水平上对现存生物类群和未知生物材料进行识别和鉴定。线粒体细胞色素C氧化酶I(COI)基因是常用DNA条形码基因之一,为研究COI基因作为DNA条形码在贝类系统进化中的评估效果,本文利用PCR技术扩增获得了60个贝类物种的353条COI基因序列,通过聚类法构建了neighbor-joining(NJ)进化树,同时还对7个物种不同地理群体的遗传进化情况进行了分析。结果表明,选用的COI基因引物在大多数贝类中通用性较强,除在珍珠贝目中的扩增效率只有10%以外,在整个研究中扩增效率达到82.7%;60个物种中除太平洋潜泥蛤(Panopea abrupta)、沼蛤(Limnoperna fortunei)和魁蚶(Scapharca broughtoni)等8个物种在进化树中的进化地位与传统系统分类具有一定差别外,其他物种的聚类关系与传统分类基本一致;对7个物种、共26个地理群体的聚类分析发现,COI基因基本能对同一物种的不同地理群体进行聚类,只有极个别群体或群体中的某个个体存在聚类混乱现象。综上所述,COI基因在一定程度上适用于贝类物种鉴别和系统发育研究,丰富了COI基因在物种鉴别应用中的科学数据。     

海参DNA条形码的构建及应用

为研究线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ (Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因作为DNA条形码鉴定海参品种的可行性,本实验采集了7种海参(Holothuroidea)43个个体并获得其线粒体COⅠ基因序列,利用DNAsar、DNAMAN和MEGA 4.1软件分析计算了7种海参的碱基组成以及不同海参之间的种间遗传距离和种内遗传距离,利用邻接法和最大简约法分别构建了分子系统树.结果表明,海参的种间遗传距离显著大于种内遗传距离,不同海参在系统树中分别形成各自独立的分支,表明以CO Ⅰ作为海参DNA条形码进行品种鉴定具有一定的可行性.在建立海参DNA条形码的基础上,设计了针对仿刺参(Apostichopus japonicas)的特异性探针.对4种海参(仿刺参Apostichopus japonicas、冰岛参Cucumaria frondosa、加州拟刺参Parastichopus californicus及梅花参Thelenota ananas)进行斑点杂交实验,结果显示,该探针具有较好的特性和较高的灵敏度,能够实现对仿刺参的鉴定.本研究为后续开展斑点杂交及基因芯片法鉴定海参种类的研究奠定了理论基础.     

鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证

为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA(eDNA)研究的鱼类引物,从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物,分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现,引物16s和COI均可以取得良好的扩增效果,通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带,引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现,只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果,能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现,16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段,COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上,我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类群落结构eDNA研究的通用引物。     

基于线粒体COI序列的DNA条形码在中国海口足类物种鉴定中的应用分析

中国海口足类动物区系具有丰富的物种多样性,是我国海洋底栖生物中的重要经济类群。口足类的属内种间鉴别特征有的极为相似,仅依靠传统的形态分类方法很难对近缘种和疑难种进行准确的鉴定。DNA条形码技术可以弥补传统形态学鉴定的某些局限,为物种鉴定提供了有效的工具。该研究探讨了利用线粒体COI序列对中国海口足类进行物种鉴定的可行性,共获得口足目4总科6科24属38个种的204条线粒体COI序列,与Gen Bank收录的14种42条口足类同源序列进行比对,结果显示口足类COI基因不存在碱基插入缺失现象,碱基组成偏倚明显,A+T含量(63.5%)显著高于G+C含量(36.5%)。基于Kimura双参数模型计算遗传距离,结果显示遗传距离随着分类阶元的增高而增大。同物种种内个体间的遗传距离变化范围在0%~3.91%,平均值为0.76%。同属内各物种间的遗传距离变化范围为6.55%~18.99%,平均值为12.91%。同科内不同属间的遗传距离变化范围为9.16%~23.32%,平均值为16.89%。不同科间的遗传距离变化范围为16.52%~26.6%,平均值为21.31%。由此可见,口足类COI基因的种间和种内遗传距离存在明显的间隙。基于COI序列构建的口足类邻接关系树显示所有包含大于1个个体的物种均可形成单系群,且节点支持率均为100%。本研究证明了COI序列作为DNA条形码标准基因在口足类物种鉴定中的有效性。此外,研究发现中国沿海分布的口虾蛄可能至少存在两个隐存种,实证了基于COI序列的DNA条形码技术能够用于口虾蛄隐存多样性的探究。     

基于COI和16S rRNA的库页岛马珂蛤遗传多样性和分子系统进化研究

本研究以库页岛马珂蛤(Pseudocardium sachalinense)为研究对象,讨论COI和16S rRNA两种DNA条形码在贝类的遗传多样性、分子进化和种类鉴定的适用性,并利用两种条形码评估库页岛马珂蛤的遗传多样性。本文在获得库页岛马珂蛤线粒体全基因组的基础上,测序获得库页岛马珂蛤群体的COI和16S rRNA序列,发现COI基因核苷酸多样性为0.00195,高于16S rRNA核苷酸多样性(0.00073)。基于COI基因的单倍型多样性为0.76,大于16S rRNA的单倍型多样性(0.318)。其次,用全线粒体基因组构建8种贝类的系统进化树为参考,发现基于COI和16S rRNA的系统进化树与参考一致,提示这两种条形码片段可用于推断贝类的分子进化关系。最后,分别对马珂蛤科和帘蛤科15属17种贝类的COI基因和16Sr DNA进行序列比较,发现COI基因和16S rRNA的种间遗传距离均是种内距离的62倍。以上结果说明,16S rRNA与COI基因一样,能有效地构建马珂蛤科和帘蛤科的系统发育关系和物种鉴定,但在分析库页岛马珂蛤的遗传多样性时利用COI基因比16S rRNA能发现更多的遗传变异。     

南极鱼类DNA条形码及分子系统进化研究

本文采用COI基因兼并引物对15种36个南极鱼类DNA进行扩增测序,并结合Gen Bank已有序列进行联配分析,对南极鱼2科22属43种共97条COI基因片段(539 bp)进行序列比较和系统发生关系研究,探索了DNA条形码技术在辅助鱼类物种鉴定和分类中的适应性与可行性。结果分析表明,43种南极鱼科和鳄冰鱼科的鱼类COI基因的平均碱基组成为T:31.9%、G:18.3%、A:22.2%和C:27.6%,具有明显的碱基偏倚性。南极鱼类的种间平均距离为0.157,种内平均遗传距离为0.002,种间平均遗传距离是种内平均距离的79倍;系统分析结果显示,除南极小带腭鱼(Cryodraco antarcticus)和罗斯海小带腭鱼(Cryodraco atkinsoni)外,其余的鱼类皆能够形成独立的分支,且与形态学分支一致。由此可见,DNA条形码对南极鱼亚目鳄冰鱼科和南极鱼科鱼类能够进行有效的物种鉴定,基于COI基因所建的NJ(neighbor-joining)树对物种分类具有较为准确的辨识力。系统发生关系表明,DNA条形码可以对除南极小带腭鱼(Cryodraco antarcticus)和罗斯海小带腭鱼(Cryodraco atkinsoni)外的南极鱼物种进行鉴定,不仅可以作为形态学的辅助手段为南极鱼分类系统的必要补充和佐证,并且可以用于探讨南极鱼类近缘种的系统发育关系。     

不同DNA条形码基因在帘蛤目贝类分类鉴定中的比较分析

DNA条形码基因已经广泛应用在海洋贝类的分类鉴定、系统发育进化、种群遗传分析等领域的研究。为进一步研究评估不同DNA条形码基因在海洋贝类鉴定中的作用,本研究利用从Gen Bank数据库随机下载的帘蛤目COI、16S r RNA、18S r RNA和28S r RNA基因序列,通过传统距离法和单系聚类法结合分析,比较了上述DNA条形码基因在鉴定物种及系统发育进化中的鉴定效率,并以本实验室已获得的部分贝类DNA序列进行了验证。结果表明,根据"10倍法则"和"2%"阈值标准,本研究中COI能够鉴定57.1%物种,16S r RNA能够鉴定60.9%,18S r RNA鉴定16.7%,而28S r RNA无法有效鉴定;多数种COI和16S r RNA基因序列的种间遗传距离和种内遗传距离存在"条形码间隙",而18S r RNA和28S r RNA序列的种间和种内的遗传距离存在显著重叠,没有明显"条形码间隙";聚类分析结果表明,基于COI基因序列,87.9%的个体与同种聚为单系,以16S r RNA序列,65.6%的个体与同种聚为单系,未聚成单系的个体则形成姐妹系,未出现不同种聚为单系现象,能够呈现与形态分类基本一致的系统发生关系;但18S r RNA和28S r RNA呈现的聚类关系相对混乱。相对而言,在鉴定帘蛤目物种时,COI和16S r RNA都能够作为条形码基因,且COI有效性更高,18S r RNA和28S r RNA基因由于种内变异较大,不适于作为条码基因。研究结果为科学选用DNA条形码基因进行帘蛤目贝类的鉴定提供了参考资料。     

基于DNA条形码技术的永暑礁泻湖鱼卵鉴定研究

为了解南海珊瑚礁鱼类的产卵时间、产卵地点和种类分布,本研究以南海永暑礁泻湖鱼卵为研究对象,根据形态学特征和DNA条形码序列信息对其进行种属鉴定分析。71个鱼卵样品根据形态学特征分为圆形和椭圆形2种类型,圆形鱼卵44个,椭圆形鱼卵27个。利用DNA条形码技术扩增测序获得了30个鱼卵样品的线粒体COI条形码序列,经BOLD数据库比对分析显示30个鱼卵样品均可鉴定到种,分属于1个目,7个科,13个种。双斑栉齿刺尾鱼有10个鱼卵,白尾栉齿刺尾鱼有4个鱼卵,为该海域的优势种类,其余各种类均为1~2个鱼卵。根据线粒体COI序列计算种内的K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离为0.002,同一个属种间的遗传距离为0.004~0.132,而同一个科不同属间的遗传距离为0.117~0.185。该研究结果表明DNA条形码技术可以作为鉴定南沙群岛珊瑚礁海域鱼卵的有效方法,能被广泛应用于南沙群岛珊瑚海区域鱼卵和仔稚鱼的鉴定工作。     

基于DNA条形码技术对江门沿岸海域夏季鱼卵的鉴定

以江门沿岸海域夏季采集到的鱼卵研究对象,利用DNA条形码技术分析鉴定鱼卵种类。本研究获得鱼卵个体有效线粒体COI序列信息217个,测序成功率为68.5%。经BOLD数据库比对分析,成功鉴定鱼卵5目14科19属20种(未知种2种);种内遗传距离为0~0.006,平均遗传距离为0.002,种间遗传距离为0.149~0.325,平均遗传距离为0.255,种间遗传距离为种内遗传的128倍;鱼卵样品以鲈形目数量最多,占51.8%;鲱形目次之,占24.8%;其中鱼卵优势种为黄斑鲾(Photopectoralis bindus)、日本鳀(Engraulis japonicus)、大甲鲹(Megalaspis cordyla)、粗鳞鮻(Chelon subviridis)、金钱鱼(Scatophagus argus)、龙头鱼(Harpadon nehereus)、亚洲(Sillago asiatica)。本次调查川山群岛东部海域获得鱼卵数量、鱼卵种类数均最多,是江门沿岸海域日本鳀、龙头鱼的主要产卵场;黄茅海、镇海湾西部水域均未获得鱼卵,可能与水域环境变化及陆源污染导致产卵环境破坏、亲体量减少有关。该研究结果揭示了江门沿岸海域夏季鱼卵分布格局,为其制定有效的产卵场保护措施提供依据,同时表明DNA条形码技术能有效地对鱼卵进行种类鉴定,可被广泛地应用于我国沿海海域鱼卵鉴定工作。