转cry 1Iem基因大豆的培育及抗虫性检测

以大豆子叶节为外植体,应用农杆菌介导法,将抗虫(cry1Iem)基因转化大豆.筛选标记为bar基因.经Glufasinate筛选,获得大量抗性植株.对转基因T_0、T_1、T_2代植株进行PCR检测,初步证明cry1Iem基因已经整合到大豆基因组中.对T2代PCR阳性植株幼嫩豆荚,采用圆盘分隔法接人初孵幼虫,进行初步的抗虫性检测,得到1株具有明显抗虫效果和7株抗虫效果较好的转基因植株.     

抗虫基因Cry8-like在大豆中的遗传转化及抗虫性初步鉴定

利用无缝克隆技术把抗虫基因Cry8-like重组到pCAMBIA3301载体上,成功构建了含有抗草铵膦筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-RSP-Cry8-like-nos。将该载体通过农杆菌介导法转入两个受体大豆品种吉农28和吉农42中,经PCR检测,吉农28和吉农42分别获得了17株和13株T_1阳性植株,36株和25株T_2阳性植株。T_2转基因植株Southern杂交结果显示,目的基因以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR检测结果表明,Cry8-like在转基因植株幼根得到了表达,而非转化受体对照未检测到荧光信号。室内抗暗黑鳃金龟幼虫鉴定结果表明,转基因植株提高了抗暗黑鳃金龟幼虫的能力。     

农杆菌介导大豆子叶节转化cry1Iem基因

利用农杆菌介导法,以东北地区种植的9个大豆基因型和国外品种Williams82的子叶节为外植体,将抗虫基因cry1Iem转入栽培大豆品种中。共转化外植体1 459个,获得84棵再生植株。采用除草剂叶片涂抹法、PCR及Bar蛋白试纸条检测法对得到大豆再生植株进行鉴定,转cry1Iem基因大豆T_0阳性植株为61株。对部分T_1转基因植株的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代。通过对部分T_1阳性转基因植株进行Southern blot分析,证明目的基因片段均已整合到受体大豆的基因组DNA中,单拷贝率为22%左右。对获得的部分T_2材料进行了室内抗大豆食心虫鉴定,有2份转基因材料抗性较对照显著提高。     

农杆菌介导法将Bt(cryⅠA)基因导入大豆的研究

构建含有Bt(cry Ⅰ A)基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt,以大豆子叶节为受体,通过农杆菌介导法将Bt基因导人大豆品种黑农37中,获得转基因植株.并进行人豆的再生和遗传转化系统优化的研究,以获得较高的转化率.结果表明:在6-BA浓度为1.7 mg·L-1时,丛生芽分化率最高,确定该品种大豆在从生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3.5 mg·L-1获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株,其中T1代PCR阳性植株19株.采用real-time PCR的方法对T1代抗性植株进行Bt基因的转录水平的分析,初步证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内.     

大豆胚尖转化体系优化和cry1C*基因转化大豆的研究

以抗大豆食心虫品系东农8004的胚尖为外植体,通过对芽诱导和芽伸长培养基进行优化,建立8004的胚尖转化体系,利用该体系进行cry1C*基因的转化,对获得的抗性再生植株进行分子鉴定和抗虫性鉴定。结果表明:在芽诱导培养基中附加1.67 mg·L-16-BA,丛生芽诱导率最高,达到80%,在芽伸长培养基中附加0.5 mg·L-1GA3和0.1mg·L-1IAA,芽伸长率最高为54%。共获得94株PPT(100μg·m L-1)抗性再生植株,PCR检测阳性14株,阳性率为14.89%。对4株T0代阳性植株进行大豆食心虫抗性鉴定,其中C-1植株的食心虫抗性明显高于野生型8004,说明在大豆中表达cry1C*基因能提高大豆对食心虫的抗性。     

利用花粉管通道法将抗虫基因(cry V)转入大豆的研究

利用花粉管通道法,在大豆的盛花期将外源抗虫基因(cry V)转入到大豆中,转化成活率达43.88%,成荚率达33.6%.将收获的的种子种植在大豆所温室中,通过卡那霉素筛选、PCR鉴定,Southern-blot检测和RT-PCR检测,共检测出5株阳性植株,确定外源抗虫基因(cry V)已转入到大豆中,转化率达1.8‰.     

RNA干扰高油GmPEPc基因转入大豆研究

通过构建GmPEPc基因的植物RNAi双元表达载体,并通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将控制油脂和蛋白合成途径的相关基因GmPEPc转入受体品种沈农9号中,通过抑制大豆内源GmPEPc基因的表达,增加油脂积累,从而获得高油的转基因大豆新品种。在大豆组织培养过程中,共切取大豆外植体407块,获得T0代转化苗35株,转化率8.9%。通过对转基因后代中目的基因的整合及表达情况进行分子鉴定。获得23株T_1代转基因后代,其中高抗草丁膦除草剂(喷施浓度300 mg·mL~(-1))14株,通过PCR检测结果表明其中12株为PCR阳性;PCR和Southern杂交检测表明,GmPEPc基因已经成功插入到转基因大豆植株基因组DNA中。对T_1代测定结果显示,转基因大豆籽粒的平均含油量比对照高9.51%,平均蛋白质含量下降5.44%。这些研究结果为筛选高油脂含量的转基因大豆新株系提供了依据,为下一步高油新品种的选育提供了种质基础。     

β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体抑制大豆抗原蛋白的表达

为幼龄动物提供优质的大豆饲料,同时有效抑制α'亚基和β亚基基因表达量,根据dsRNAi原理,以α'亚基基因RNAi重组植物表达载体p CAMBIA3301-PFNZ-BADH为基础,构建以BADH安全标记为筛选标记的α'亚基和β亚基基因双价RNAi植物表达载体。用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节,并对再生植株进行分子生物学检测。结果表明:成功构建β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体,并获得大豆转基因植株。T1转基因大豆植株经PCR检测得到11株阳性转化株,经Southern杂交检测证明构建的双价植物表达载体已经以1~2个拷贝整合到大豆基因组中,实时荧光定量PCR检测表明β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因的表达被明显抑制。     

大豆炸荚基因GmAGL8的转基因鉴定与功能初探

炸荚是大豆的一种自然特征属性,是影响大豆产量的重要因素之一。本研究以前期获得的转大豆炸荚相关基因GmAGL8的T_1代植株为材料,继续繁育获得T_2和T_3代;采用PCR和RT-q PCR检测方法对转基因植株进行基因遗传稳定性和表达情况分析;并以野生型中黄10号为对照,对大豆炸荚性状进行了鉴定分析。结果表明:转基因植株阳性率T_1代为87.5%,T_2和T_3代均达到100%,说明GmAGL8基因已基本能够在转基因后代中稳定遗传。RT-q PCR检测结果显示,转基因植株中GmAGL8基因的相对表达量都明显高于非转基因植株,且各转基因植株之间表达量具有差异性。对T_1、T_2和T_3代植株炸荚率进行了统计,不同世代转基因大豆的平均炸荚率为9.09%,而非转基因大豆炸荚率为83.3%,转基因与非转基因大豆之间炸荚率存在显著差异。综上所述,GmAGL8基因已基本实现在大豆转基因后代中稳定遗传并正常表达,表型鉴定结果初步证明了GmAGL8基因与大豆炸荚性状相关。     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。