湖南省马铃薯主产区马铃薯病毒种类及流行分析

马铃薯是世界第四大粮食作物,其病毒病危害严重。2010年对湖南马铃薯主产区采集的66个病毒标样进行了RT-PCR检测,结果表明,检测出的马铃薯病毒有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)。其中PVS的检出率最高,为54.5%,其次是PVX,检出率为45.5%,PVY的检出率为39.4%,PSTVd和PVA的检出率均为21.2%,PLRV的检出率为18.2%。2~4种病毒的复合侵染现象较为普遍。PVY中重组型PVY占85.7%。     

马铃薯病毒外壳蛋白融合基因转化马铃薯及其抗病性分析

将多种病毒的有效核酸片断拼接成融合基因转入马铃薯可获得多抗马铃薯材料。针对马铃薯生产中分布广泛、危害严重并经常混合感染的马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和马铃薯S病毒(PVS),开展了利用基因工程方法获得兼抗4种马铃薯病毒转基因马铃薯材料的研究。试验在前期获得含4种马铃薯病毒外壳蛋白基因片段的质粒pART27-XSYV-rh的基础上,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种‘陇薯3号’,PCR扩增和PCR-Southern杂交证明,4价融合基因已整合到马铃薯基因组中。qRT-PCR分析表明,该融合基因在转基因植株中能正常表达。3株转基因植株的抗病性鉴定结果表明,2株对4种病毒同时具有抗性;1株对PLRV侵染表现阳性,对另外3种病毒同时具有抗性。     

马铃薯病毒检测中DAS-ELISA的改进及注意问题

分别采用改进的DAS ELISA和常规DAS ELlSA法同时对主要马铃薯病毒 (PVX、PVY、PVS、PVM和PLRV)进行检测 ,其检测结果完全一致 ,且其灵敏度也基本相同。局部改进的DAS ELISA方法简便、快速 ,成本更低 ,适合于种薯生产中大量样品的马铃薯病毒的快速检测     

马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立

马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯M病毒(PVM)和马铃薯A病毒(PVA)是马铃薯生产田中发生率较高、危害较严重的病毒,因此,建立特异性强、灵敏度高、检测速度快的RT-PCR分子检测体系对保障马铃薯种薯质量具有非常重要的意义。试验筛选了6种病毒的特异引物、优化了PCR部分的试剂以及确定了退火温度。结果表明,当Mg2+浓度为2.6 mmol/L、d NTPs浓度为0.1 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,以及退火温度为55.5℃时反应体系最稳定。最终,建立了一套通用RT-PCR检测体系,只需要变换每种病毒的引物,就可以实现对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA病毒的RT-PCR检测。每种病毒检测灵敏度均能达到pg以上。     

抑制马铃薯无性系植株病毒的积累减少马铃薯卷叶病毒病的传播

在培育抗病毒品种的工作中,抗侵染是最常选择的特性。事实上,马铃薯抗卷叶病毒(PLRV)病的育种,这一仔细考虑的选择可能是抗性的唯一类型(Davison,1973),而其他类型大多被忽视。近年的研究表明,一些马铃薯无性系和栽培品种对PLRV的抗性至少有8个组成部分(Barker等,1985,1986;     

应用DAS-ELISA法同时检测多种马铃薯病毒

报道了使用多价血清同时检测多种马铃薯病毒的快速DAS ELISA法。实验分别用快速DAS ELISA法和常规DAS ELISA法检测PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV5种主要马铃薯病毒进行比较 ,二者阳性率和灵敏度基本相同 ,但快速法比常规法操作简便、节省时间、节省材料 ,且快速法重复性好 ,结果可靠 ,表明快速DAS ELISA法是一种直观、实用、快速、准确可靠的检测方法 ,适合种薯生产中大量样品的多种主要马铃薯病毒的快速检测。     

马铃薯PVY和PLRV病毒的TC-RT-PCR检测

传统的RT-PCR技术检测病毒需提取总RNA,RNA容易降解。利用试管捕捉反转录扩增(Tube cap-ture RT-PCR,TC-RT-PCR)方法检测了PVY和PLRV 2种病毒,实现了不需提取总RNA也可在同一反应中同时检测2种病毒。根据已报道的引物用TC-RT-PCR的方法对PVY和PLRV的外壳蛋白基因进行了检测。结果表明,TC-RT-PCR能够成功的检测出感染PVY或PLRV以及2种病毒共同侵染的样品,扩增产物序列长度均与设计片段的长度相符,分别为781和364 bp,2种病毒扩增产物的测序结果同Gene Bank中已知的序列比对后的同源性均高达97%以上。该技术为单独或复合感染的马铃薯病毒的检测提供了更加方便、高效的方法。同时测得试验PVY病毒样本属于PVYNW株系。     

云南省马铃薯脱毒试管苗和微型薯病毒检测与分析

病毒病是制约马铃薯产量和质量的重要因素。马铃薯脱毒试管苗、微型薯是生产脱毒种薯的重要环节。本研究于2010~2013年对收集自云南省的试管苗274个、微型薯356个,共计630个样品。应用电子显微镜观察,并采用DAS-ELISA检测了8种病毒:马铃薯S病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯M病毒、番茄斑萎病毒和烟草环斑病毒,发现试管苗和微型薯中马铃薯S病毒检出率最高(21.27%),其次是PLRV(5.71%);还检测到了新出现的侵染马铃薯的番茄斑萎病毒和烟草环斑病毒。研究结果为马铃薯种薯生产过程中病毒病的检测防控提供了参考。     

马铃薯X病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是侵染马铃薯重要病毒之一,通常引起花叶症状,在田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产。PVX尚无有效的药剂可以防治,加强对PVX的快速检测是一个亟待解决的课题。本研究应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)技术检测马铃薯X病毒。结果表明:IC-RT-PCR方法可检测出稀释至1.0×10-3的粗汁液中的病毒;RT-PCR方法可从稀释至1.0×10-4的总RNA中扩增出特异的目的条带。这两种方法均具有较高的检测灵敏度,均可用于马铃薯X病毒的检测。     

我国马铃薯抗病毒基因工程研究进展

10年来我国已合成克隆了PVX、PVY、PLRV的外壳蛋白基因 ,复制酶基因 ,蛋白酶基因 ,基因调控序列 ,核酶cDNA及其他各种基因并进行了序列分析。建立了完善的致瘤农杆菌介导的马铃薯转化技术。通过外壳蛋白基因介导 ,复制酶基因介导 ,表达基因调控序列和核酶等基因工程途径 ,获得了一批不同程度上抗PVX、PVY、PVX和PVY ,PVY和PLRV ,PLRY及高抗PSTVd的转基因马铃薯栽培种。这些转基因马铃薯多数已进入田间试验。不久一批抗病毒的优质高产的马铃薯栽培种 ,经过进一步发育 ,必将在生产中推广应用。抗病毒转基因马铃薯培育成功 ,为我国马铃薯病毒病害防治开辟了一条崭新的途径 ,也必将有力地促进我国马铃薯生产的发展     

建兰花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值,建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。根据CyMV的外壳蛋白基因序列设计4对特异性引物,经过优化反应条件,建立该病毒的RT-LAMP 检测方法,并进行LAMP检测的特异性、敏感性检测。该方法能特异扩增CyMV,与其他4种病毒（齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒和小苍兰花叶病毒）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CyMV,可省去电泳分析的时间。针对CyMV建立的RT-LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点,适用于在进境检疫及种苗繁育过程中的检测鉴定。     

Cryotherapy of Potato Shoot Tips for Efficient Elimination of Potato Leafroll Virus (PLRV) and Potato Virus Y (PVY)

Viral diseases constitute a major constraint to high yield and high quality production of potato. Potato leafroll virus (PLRV) and Potato virus Y (PVY) are among the most damaging potato viruses and are prevalent in most potato growing areas. In the present study, attempts were made to eliminate PLRV and PVY by three cryogenic protocols, i.e., encapsulation-dehydration, encapsulation-vitrification and droplet. Results showed that both PLRV and PVY could be efficiently eliminated by cryogenic treatments with 83–86% and 91–95% of frequencies of virus-free plantlets obtained for the former and latter, respectively. Frequencies of virus-free plantlets produced by cryogenic treatments were higher than those by meristem culture (56% for PLRV and 62% for PVY) and thermotherapy (50% for PLRV and 65% for PVY), and similar to those by thermotherapy followed by meristem culture (90% for PLRV and 93% for PVY). Survival (75–85%) and regrowth (83–89%) from cryo-treated shoot tips were higher than those from meristem culture (50–55%) and thermotherapy followed by meristem culture (40–50%), but similar to those from thermotherapy (80–87%). The morphology of the plantlets regenerated from cryo-treated shoot tips was similar to that of non-treated plantlets. Thus, cryotherapy would provide an alternative method for efficient elimination of potato viruses, and can be simultaneously used for long-term storage of potato germplasm and for production of virus-free plants.     

Ultramicro-ELISA with a fluorogenic substrate for detection of potato viruses

Summary A double-antibody ELISA is described in which polystyrene-covered polyvinylchloride plates with 10 μl test volume in the wells are used as a solid phase. A fluorogenic substrate, 4-methylum-belliferyl phosphate is used instead of a colorigenic substrate. The plates are loaded with 10 μl samples by using a 50-channel micropipette and fluorescence units read at 0.16 mm thickness with a special measuring device. The practicability and sensitivity of the method are exemplified by the detection of potato viruses X, Y and M (secondary infections) and potato leafroll virus (primary infections), in leaf and tuber extracts. Ultramicro-ELISA is as reliable in detecting the viruses as the standard ELISA. Because of the very small volumes used in the wells, chemicals, antibodies and alkaline phosphatase are reduced by 95% as compared with the standard test.

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Zusammenfassung Es wird ein Ultramikro-ELISA in der Form eines Doppelantik?rper-ELISA (Clark & Adams, 1977) beschrieben, in dem als feste Phase polystyrolbeschichtete Polyvinylchlorid-Folien mit einem Füllvolumen von 10 μl verwendet wurden. Die Dosierung erfolgte in einem Raster von 5×10 mit einem speziellen 50-kanaligen Mikropipetter. Alle Inkubationsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Ausspülen mit PBS-Tween wurden die Folien 20 Minuten mit Aqua dest. gewaschen. An Stelle des chromogenen Substratesp-Nitrophenylphosphat wurde 0,0005 mol/l 4-Methylumbelliferylphosphat in Diethanolaminpuffer verwendet. Die Reaktionszeit für das fluorogene Substrat betrug 20 Minuten. Ein Abstoppen der Substratreaktion entfiel, da die L?sung nach erfolgter Reaktion mit einem Mikropipetter auf eine im Raster 5×10 gekammerte Glasmessküvette überführt wurde. Die Messung der Fluoreszenzintensit?t erfolgte bei 0,16 mm Schichtdicke in einem speziellen Auswerteger?t. Dieser Ultramikro-ELISA, der zur quantitativen Bestimmung des α₁-Fetoproteins Anwendung findet (Horn et al., 1981; Hoffmann-Blume et al., 1983), wurde in seiner Nachweissicherheit mit einem üblichen Doppelantik?rper-ELISA verglichen (Richter et al., 1979). In die Untersuchungen wurden Blattpress?fte von Pflanzen einbezogen, die mit Kartoffelblattroll-Virus (PLRV), Kartoffel-Virus Y (PVY) und Kartoffel-Virus M (PVM) infiziert waren. Des weiteren wurden das Kartoffel-Virus X (PVX) sowie die Viren PVY und PVM in sekund?rinfizierten Knollen und Bl?ttern von Kartoffelzuchtst?mmen (spontane Freilandinfektionen) nachgewiesen. Zum Nachweis prim?rer Infektionen mit PLRV wurden gesunde Mutterpflanzen der Sorte Adretta an zwei Terminen mit Hilfe von Blattl?usen infiziert. Die mit beiden ELISA-Verfahren erhaltenen Ergebnisse stimmten überein. In Blattpresss?ften konnten die Viren bis zu einer Verdünnung von 10⁵ (PVM), 10³ (PVY) und 10² (PLRV) nachgewiesen werden. In 20 Individuen von Kartoffelzuchtst?mmen wurden mit beiden Verfahren übereinstimmend PVX und PVY in 5 Knollen- und Blattproben festgestellt; PVM wurde in 12 Blatt- und 13 Knollenproben nachgewiesen. Die in Blattproben ermittelten Extinktionen bzw. Fluoreszenzintensit?ten lagen um den Faktor 2–5 h?her als die Werte der Knollenextrakte. In 20 mit PLRV prim?rinfizierten Mutterpflanzen wurden im Rahmen der Blattuntersuchungen Ende Oktober mit beiden Verfahren 10 infizierte Stecklinge ermittelt. Die Ergebnisse wurden durch die Augenstecklingsprüfung, bei der 9 infizierte Pflanzen gefunden wurden, unterstützt. Bei der Untersuchung prim?rinfizierter Knollen wurde nach einer Zwischenlagerung von 2,5 Monaten in 17 von 18 dieser Knollen eine PLRV-Infektion best?tigt. Die anschliessende Augenstecklingsprüfung ergab nur 12 PLRV-infizierte Pflanzen. Eine Abh?ngigkeit vom Infektionszeitpunkt wurde nicht gefunden. Der vorgestellte Ultramikro-ELISA besitzt nach diesen Ergebnissen die gleiche Sensitivit?t wie ein üblicher Standard-ELISA. Bedingt durch die geringen Füllvolumina k?nnen jedoch Chemikalien, Antik?rper und alkalische Phosphatase um 95% der im Vergleich zum Standard ben?tigten Mengen reduziert werden.

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Résumé Dans ce travail est décrit une méthode Ultramicro-ELISA avec le principe du double anticorps-ELISA (Clark & Adams, 1977). La partie réceptrice solide se compose de feuilles en polyvinylchloride additionnée de couches en polystérole avec une capacité de 10 μl par alvéole. La sensibilisation des plaques qui correspondent à une grille de 5×10 alvéoles, est effectuée avec une micro-multipipette à 50 canaux. L'incubation a lieu à température ambiante. Après rin?age des plaques avec le PBS-Tween le lavage est effectué durant 20 minutes avec de l'eau distillée. A la place du substratp-nitrophénylphosphore on utilise une solution de 4-methylumbelliferylphosphore 0,0005 mol/l avec un tampon de diethanolamine. La durée de réaction du substrat fluorescent est de 20 minutes. Un stoppage de la réaction est superflu, étant donné qu'une fois la réaction obtenue, la solution est prélevée avec une micro pipette et versée sur une grille-cuvette en verre avec 5×10 champs. La mesure de l'intensité fluorescente est effectuée avec un appareil spécial sur une couche de 0,16 mm. Cet ELISA Ultramicro-test utilisé pour la détermination quantitative de la protéine α-1 Feto (Horn et al., 1981; Hoffmann-Blume et al., 1983) a été comparé sur sa fiabilité avec un double anticorps-ELISA courant (Richter et al., 1979). Les examens comprenaient des jus de feuilles de pommes de terre contaminées par PLRV, PVY, PVM. On a également détecté le PVX, PVY et PVM, infections secondaires de tubercules et feuilles de clones de pommes de terre. Pour la détection des infections primaires de PLRV, des plantes-mères saines de la variété Adretta ont été infectées à deux dates à l'aide de pucerons. Les résultats obtenus avec les deux méthodes ELISA concordent dans tous les essais. Dans le jus de feuilles, les virus ont été détectés jusqu'à une dilution 10⁵ (PVM), 10³ (PVY) et 10² (PLRV). Sur les 20 clones examinés on a décelé avec les deux méthodes 5 cas de PVX et PVY dans les échantillons de tubercules et feuilles. PVM a été détecté dans 12 cas sur les feuilles et 13 fois sur les tubercules. Les extinctions, c'est-à-dire les intensités fluorescentes, sont 2 à 5 fois plus élevées à partir de jus de feuilles que sur du jus de tubercules. Sur 20 plantes qui présentaient une infection primaire, on a obtenu par des analyses foliaires des boutures à fin octobre, 10 individus infectés avec chaque méthode. Ces résultats ont été confirmés par des tests d'indexage qui ont donné 9 individus infectés. Lors de la détection d'infections primaires, après entreposage des tubercules pendant 21/2 mois, on a obtenu 17 tubercules positifs sur 18 contaminés de PLRV. L'indexage d'oeilletons a permis de déceler 12 individus malades sur ce même matériel. On a pas observé de différence selon l'époque d'infection de la plante-mère. Cela avait cependant été démontré lors d'une étude plus conséquente (Richter et al., 1983). Selon les résultats obtenus avec les virus de la pomme de terre PVX, PVY et PVM d'infections secondaires, ainsi que du PLRV d'infections primaires l'ultramicro-test ELISA offre la même sensibilité que le test ELISA standard. En raison des petits volumes des plaques, les substances chimiques, anticorps et phosphatase alcaline, peuvent être réduites de 95% comparativement avec la méthode traditionnelle.

     

Production of seed potatoes in Cyprus: incidence and economic importance of virus diseases

Summary Since 1981 seed potatoes have been produced on a semi-commercial scale in Cyprus by single multiplication of imported class A stocks. The main virus in these locally produced seed potatoes was potato leaf roll virus (PLRV) which was detected in 369 of 658 seed crops examined, at an average incidence of ca 1.5% (range 0.1%–15%). Tuber infections were detected in 203 of 223 samples tested, at an average incidence of ca 6.8% (range 1–32%), indicating a considerable spread of the virus during local seed multiplication. Potato viruses Y, X and A, and alfalfa mosaic virus occurred at much lower incidence than PLRV. The effect of secondary PLRV infection on ware-potato yield was determined in the cultivars Spunta and Cara, each planted on two different dates. In all four cultivar-planting date combinations there was a very close negative correlation between yield and virus incidence. At 100% infection, losses in total yield varied from 46% (later planting of Cara) to 72% (earlier planting of Spunta). The threshold level of infection for significant losses was ca 10%.     

马铃薯抗PLRV育种的家系遗传分析

对母本抗PLRV、父本免疫PVX、PVY按Line×tester (12× 3)设计获得的 36个家系 ,通过 1998～ 2 0 0 0年大田暴露试验 ,进行PLRV感染率、平均单栋结薯数量和重量的配合力及遗传分析 ,结果表明 :PLRV感染率的遗传力为 71 6 8% ,特殊配合力负值最高为 - 6 85 ,母本一般配合力负值最高为 - 14 87,父本一般配合负值最高为 - 3 13,选择一般配合力负值较高母本和特殊配合力负值较高的组合是获得高抗PLRV后代的前提 ;单株结薯数量的遗传力为 5 0 4 8% ,组合特殊配合力最高为 2 1,母本一般配合力最高为 2 8,父本一般配合力最高为 0 3,特殊配合力较高的组合在一般配合力高的和差的亲本组合中出现频率较高 ,父本在块茎数量的遗传中起重要作用。单株结薯重量的遗传力为 75 19% ,特殊配合力最高为 0 5 8,母本一般配合力最高为 0 4 2 ,而父本最高为0 33,产量的亲本选配应以一般配合力为主     

CIP家系在河北坝上的评价

在适宜的病毒侵染条件下 ,对将PLRV抗性引入高度抗PVX、PVY的CIP家系群体 ,经 1998～ 2 0 0 0年大田暴露试验 ,在我国首次进行了PLRV抗性分离、薯块形成评价和单株筛选鉴定 ;同时通过亲本在PLRV抗性、产量构成因素方面的方差分析和一般配合力测定 ,表明后代对PL RV的抗性主要来源于母本 ,产量构成因素则决定于双亲     

Host genes and transgenes that confer resistance to a Scottish isolate of potato leafroll virus are also effective against a Peruvian isolate

Summary Potato genotypes with host gene-mediated resistance (host-MR) and coat protein-mediated transgenic resistance (CP-MR) to potato leafroll virus (PLRV), were inoculated with a Scottish and a Peruvian isolate of PLRV. The coat protein transgene had been cloned from the Scottish PLRV isolate which had also been used during the screening and selection of genotypes with host resistance. Significantly less PLRV accumulated in plants with either host-MR or CP-MR than in plants of susceptible genotypes or in non-transformed control plants, but the two forms of resistance were equally effective against both PLRV isolates.     

Simplified extraction method for ELISA and PCR detection of potato leafroll luteovirus primary infection in dormant potato tubers

This report describes a simple, rapid and inexpensive procedure for sampling large numbers of dormant tubers for analysis of potato leafroll luteovirus (PLRV) infection. The procedure uses a common electric drill to simultaneously remove and macerate tuber-eye samples for detection of PLRV by the enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) and the polymerase chain reaction (PCR). By using these sampling and analysis approaches, 19 of 20 different PLRV isolates were detected in dormant tubers from plants with primary infections. Results from the dormant tuber analysis, were verified by planting the tubers and testing leaf tissue by ELISA and PCR. Similar sampling and testing done on healthy dormant tubers and sprouts from the tubers consistently gave negative results as expected.