抗黄曲霉毒素合成中关键蛋白AFLP(OmtA)的单克隆抗体制备与鉴定

AFLP(Omt A)蛋白是黄曲霉毒素合成晚期的关键酶。用大肠杆菌表达的重组SUMO-AFLP融合蛋白作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,选取小鼠阳性血清的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选,筛选出可以稳定分泌抗AFLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。再用阳性细胞株制备腹水抗体,经辛酸-硫酸铵纯化抗体后,用间接ELISA、Western杂交等方法对抗体的特性进行鉴定。筛选出1株能稳定分泌抗AFLP单克隆抗体的细胞株3B4 3B10,亚类鉴定单抗为Ig G2a。间接ELISA法测定该细胞腹水抗体的效价为1∶256 000,Western杂交结果显示抗AFLP单克隆抗体能特异性识别AFLP重组蛋白及黄曲霉菌内的天然AFLP蛋白。用1μg·m L~(-1)单克隆抗体检测AFLP蛋白,其线性检测范围为1.259~57.335ng·m L~(-1),检测限为0.851ng·m L~(-1),R~=0.998 3。本文成功制备抗黄曲霉毒素合成中天然AFLP蛋白的单克隆抗体,特异性和灵敏度均较高,为进一步研究AFLP的表达及功能机制奠定了基础。     

抗黄曲霉毒素单链抗体基因的克隆与表达

为降低黄曲霉毒素大量样品的制备成本,在实验室已有的抗黄曲霉毒素单克隆抗体8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链（VH）和轻链可变区（VL）基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker) 编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因, 并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB 5E 上,使单链抗体以噬菌体展示形式在大肠杆菌TG1 中表达。间接竞争ELISA方法检测到该ScFv对黄曲霉毒素B1的抑制率（IC50）值为0.57ng/mL,表明该单链抗体与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性,且具有很高灵敏度。     

大麦黄矮病毒分离物间单克隆抗体的差异(续完)

引言材料和方法病毒与免疫细胞与培养液细胞融合杂种细胞与抗体的命名免疫球蛋白分类鉴定酶联免疫吸附测定腹水液制备结果杂种细胞无性繁殖免疫球蛋白亚类鉴定(以上内容见本刊85年第6期44-46页)单克隆抗体的专化性:用ELISA间接法(表1),     

油菜薹中醚菊酯酶联免疫(ELISA)快速检测方法建立

为快速有效监控蔬菜(油菜薹)醚菊酯农药残留,采用醚菊酯与牛血清白蛋白偶联物(ethofenproxBSA)抗原免疫新西兰大白兔获得抗醚菊酯多克隆抗体。以醚菊酯与卵清白蛋白偶联物(ethofenprox-OVA)为检测抗原,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法试验。通过棋盘格实验确定了最佳抗原包被反应质量浓度为0.25μg/m L,最佳抗原包被条件为37℃孵育2h;一抗最佳稀释度为1∶32 000;最佳p H值与离子浓度分别为6.0和0.16mol/L;最佳封闭试剂与有机溶剂分别为脱脂奶粉和10%甲醇/PBS。在此优化条件下,建立了醚菊酯竞争抑制曲线,抗体的灵敏度(IC50)为0.28μg/m L,检测线性范围(IC20~IC80)为0.079 8~3.578μg/m L。采用该方法对市场抽样进行加标回收测定,平均回收率在75.26%~97.56%之间,实际样品检测间接ELISA与GC/MS检测结果相关性系数达到0.994,灵敏度、精密度和准确度均符合快速检测要求。该法为快速、简便、低耗的醚菊酯免疫检测方法提供了可能。     

花生丛枝病病原的血清学研究

本研究首次制备了花生丛枝病（ＰＷＢ）植原体的专化性鼠腹水抗体，效价为１：１２８０，比较了５种间接ＥＬＩＳＡ方法检测植原体的效果，并对６种植原体病原提纯物进行了血清学研究。结果表明，鼠腹水抗体除与ＰＷＢ有血清学反应外，还与豇豆从枝病原（ＣｏＷＢ）具有一定的血清学关系，而与ＴＷＢ、ＣｈＷＢ、ＳＷＢ和ＢＷＢ无血清关系。     

抗黄曲霉毒素单克隆抗体F(ab')2片段的制备与活性

为剧毒靶标(黄曲霉毒素)绿色分析提供高效抗体,在已有抗黄曲霉毒素杂交瘤细胞株1Cll的基础上,通过小鼠腹水法制备单克隆抗体,经胃蛋白酶酶解,制备F(ab')2片段,发现在优化条件37C、pH4.1柠檬酸缓冲液中酶解4.5h,可高效制备F(ab')2片段.通过酶联免疫吸附法(ELISA)比较了抗体片段与原始抗体的识别活性,发现F(ab')2片段效价达到1∶320000,是原抗体效价的1.5倍;灵敏度(IC50)为8.7pg/mL,保持了原抗体的抗原结合能力.     

基于一步法RT-PCR的瓜类单粒种子携带CGMMV的快速检测技术

为探究直接检测瓜类单粒种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的快速检测技术,以一步法RT-PCR为基础,构建同时扩增CGMMV基因组3′端和5′端基因的(一步法)双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR和巢式双重IC-RT-PCR技术,灵敏度分别为10-3、10-3、10-4,巢式双重IC-RT-PCR灵敏度比双重RT-PCR、双重IC-RTPCR高10倍。对不同种质、不同来源的种子及种子的不同部位进行检出率比较,巢式双重IC-RT-PCR检出率高于其它2个检测技术,试验种子种表带毒检出率高于种子组织研磨物,商用种子种表带毒检出率低于种子组织研磨物。为有效阻断毒源,建议同时对种表和种子组织研磨物进行检测,种表采用双重RT-PCR检测,种子组织研磨物采用双重IC-RT-PCR或巢式双重IC-RT-PCR检测。     

粮油产品T-2毒素单克隆抗体研制及应用

以T-2毒素与琥珀酸为原料,通过琥珀酸酐法合成出T-2毒素半抗原T-2HS,再通过活泼酯法,将T-2毒素半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)共价偶联,合成出T-2毒素人工抗原T-2HSBSA和T-2HS-OVA,以T-2HS-BSA作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合和阳性筛选,共获得4株T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别是1D6、2A8、2C5和4G3。其中2C5分泌的抗体灵敏度(IC50)最高,达0.13μg/kg,特异性强,与HT-2的交叉反应率仅为4%,与FB1、DON、ZEN无交叉反应。进一步利用该抗体建立了间接竞争ELISA检测方法,最低检测限为0.015μg/kg,检测范围(IC20~IC80)为0.05~57.6μg/kg,该方法对大豆、玉米、花生等粮油产品的检测范围为0.5~576μg/kg,在线性范围内加标回收率为93.5%~107.5%。本研究建立的检测方法可用于大豆、玉米、花生等多种粮油产品中T-2毒素的检测。     

GICA-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒的新方法

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国进境植物检疫性有害生物.为解决普通RT-PCR不能直接检测大豆病种子中该病毒的问题,将简便快速的胶体金免疫层析技术(GICA)和高灵敏度的普通RT-PCR检测技术有机地结合起来,建立了GICA-RT-PCR检测新方法.即先用GICA捕获病毒,将捕获的病毒直接进行RT-PER扩增,简化了检测的步骤,提高了检测的灵敏度.结果表明:用该方法检测提纯病毒灵敏度达到0.01μg·mL-1、检测大豆病叶和病大豆种皮,灵敏度达到10-4,分别比GICA检测提高了20倍、10倍和100倍.GICA-RT-PCR可进一步确认GICA的结果.     

小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备

为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础.