白藜芦醇合酶基因在花生根中的特异表达

利用花生白藜芦醇合酶基因特异片段,体外合成带地高辛标记的正、反义RNA探针;并与花生根的组织切片进行RNA原位杂交。结果表明,该基因的转录表达在根的韧皮部,其他组织中未见表达;酵母浸提液处理可使该基因的转录表达明显增强。     

花生白藜芦醇合成酶基因家族序列克隆及分析

本研究以花生H2007为材料，从花生基因组中扩增出约500bp的白藜芦醇合成酶基因（Resveratrol synthase，RS）的保守序列，该序列与已发表的来源于花生的RS推导的蛋白序列相似性为91%。根据获得序列设计巢式基因特异性引物，以紫外辐射后花生叶片总RNA反转录成的cDNA作为模板，通过3’-RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends），获得15个不同RS基因的片段，序列分析结果表明， 扩增得到的15个白藜芦醇合成酶基因片段与已报道的基因的序列相似性为86%-98%。RS的部分编码区聚类分析的结果表明这15个序列遗传距离在0.05之内(图5)。15个RS基因的3’-UTR碱基长度不等，最短的有69bp，最长的有244bp，两两比较相似性为23%～100%。四组RS基因的部分编码区聚类分析结果与3’-UTR 区相同。     

光叶花生两个重要基因片段的克隆和序列测定

从不亲和野生花生Arachis glabrata Benth中提取DNA，在多重序列比对的基础上设计PCR引物，成功扩增出约350、750bp的两个片段，与DES和RS基因片段预期分子量相符。PCR产物与T栽体连接，转化受体菌XL1-Blue，获得了白色菌落，挑取白色菌落在液体培养基中过夜培养，经TTE溶液和热处理后进行PCR扩增，获得了载有目的基因片段的阳性重组子，测序和序列比对分子的结果说明，DES和RS基因片段克隆成功。这是首次从不亲和野生花生A.glabrata Benth中克隆出的基因片段，该片段可用作探针克隆相关基因全编码区。     

花生球蛋白基因片段的克隆

为克隆花生贮藏蛋白基因建立了花生未成熟种子的cDNA文库。根据大豆贮藏蛋白的保守区设计特异引物，从花生cDNA文库中扩增出450bp的特异性产物。经过测序分析表明与大豆球蛋白各亚基基因的同源性均达90％以上，说明已得到花生球蛋白基因的cDNA片段。该片段可以作为探针从cDNA文库中筛选花生球蛋白基因的cDNA全序列。     

玉米隐性核不育保持系表达载体构建

在Genebank中搜索花粉致死基因Zm AA1、花粉育性恢复基因Ms45、粉质胚乳突变基因Mucronate及各基因特异调控因子和终止子序列,并在目的片段的上下游设计增加同尾酶Spe I(Nhe I、Xba I)和酶切后具有各种类型的DNA片段的Esp3I酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,命名为puc-Zm AA1、puc-Ms45、puc-Mc。采用传统酶切连接的方法将目的片段构建到植物表达载体p CAMBIA3300上,并用热击法将重组质粒导入农杆菌LBA4404及EHA105中,酶切、PCR检测及核苷酸序列测定证明,植物表达载体构建成功。     

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）花瓣为材料，用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA，根据已报道的康乃馨ACC氧化酶（1－aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）基因的序列设计并合成一对引物，通过RT－PCR方法获得一约1.2kb特异片段，把该片段连接到PGEM－Teasy vector上进行测序，其全长共1156bp，编码区915bp，共编码304个氨基酸残基。序列分析结果表明该序列与国外Savin Kw报道的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符。推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。     

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列.以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体.经SalI和KpnI双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体.此载体可用以培育抗根结线...     

FAD2和γ-TMT基因双价种子特异表达载体的构建及对花生的转化

根据已发表的γ-TMT基因序列(GenBank AF104220),从拟南芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA中分离得到γ-TMT基因,根据已发表的油菜(Brassica napus)种子贮藏蛋白基因特异表达的2S启动子(登录号J02798)序列,从油菜DNA中分离得到2S启动子。为了同时提高花生中维生素E和油酸含量,构建得到了双价种子特异表达载体pCAMBIA1300AT,它带有FAD2基因反义RNA干扰体和γ-TMT基因的种子特异表达单元。该载体已登录在GenBank上(登录号FJ362601)。通过农杆菌C58介导转化花生品种闽花6号,获得PCR阳性的转化植株。     

花生ASR基因的扩增和生物信息学分析

ASR基因(脱落酸、胁迫、成熟诱导基因)是近年来从植物中发现的一类基因,该基因参与植物对低温、干旱、渗透压、脱落酸的胁迫应答.目前在多个植物中克隆了ASR基因,研究以番茄ASRl基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列并进行拼接.根据花生的EST拼接序列设计引物进行RT-PCR扩增,获得一条大小为641bp的...     

非编码RNA BcNR1在菜心中的克隆及表达分析

非编码RNA是近年来新发现的一类在生物体内广泛存在的特殊基因.以菜心[Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino vat.utilis]为实验材料,根据普通白菜花粉特异的非编码RNA基因Bc MF11的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从菜心中克隆出BcMF11的同源基因全长序列,命名为BcNR1 (GenBank登录号为EF363720).序列分析显示,该基因全长801 bp,缺乏明显的开放阅读框,而且在序列中多处出现终止密码子,具有非编码RNA基因的序列特征.RT-PCR表达分析结果显示BcNR1是菜心花粉发育特异表达的基因,推测该非编码RNA基因在植物花粉发育中发挥作用.