半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。     

用基因枪法将小麦病程相关蛋白基因TαPR-1导入小麦的研究

为验证小麦病程相关蛋白基因TαPR-1的功能，利用gus基因瞬间表达技术对基因枪法转化小麦幼胚的两个重要参数金粉用量和轰击距离进行了优化。研究结果表明,金粉用量为250．0μg．轰击距离9cm的轰击参数最为理想，GUS瞬间表达率和平均蓝点数分别可达89．8％和33．7个。采用此轰击参数．将TαPR-1基因导入扬麦158幼胚．经3～5mg／L Bialaphos筛选获得49株抗性再生植株．经PCR、Southern杂交分析．其中2株为阳性植株．转化率为0．11％。对转基因小麦植株进行苗期离体叶段和田间成株白粉病接种鉴定．初步结果表明，转基因植株对白粉病抗性与对照相比无明显差别。     

用基因枪法将小麦病程相关蛋白基因TaPR-1导入小麦的研究

为验证小麦病程相关蛋白基因TaPR-1的功能,利用gus基因瞬间表达技术对基因枪法转化小麦幼胚的两个重要参数金粉用量和轰击距离进行了优化.研究结果表明,金粉用量为250.0 μg,轰击距离9cm的轰击参数最为理想,GUS瞬间表达率和平均蓝点数分别可达89.8%和33.7个.采用此轰击参数,将TaPR-1基因导入扬麦158幼胚,经3～5 mg/L Bialaphos筛选获得49株抗性再生植株,经PCR、Southern杂交分析,其中2株为阳性植株,转化率为0.11%.对转基因小麦植株进行苗期离体叶段和田间成株白粉病接种鉴定,初步结果表明,转基因植株对白粉病抗性与对照相比无明显差别.     

转cry 1Iem基因大豆的培育及抗虫性检测

以大豆子叶节为外植体,应用农杆菌介导法,将抗虫(cry1Iem)基因转化大豆.筛选标记为bar基因.经Glufasinate筛选,获得大量抗性植株.对转基因T_0、T_1、T_2代植株进行PCR检测,初步证明cry1Iem基因已经整合到大豆基因组中.对T2代PCR阳性植株幼嫩豆荚,采用圆盘分隔法接人初孵幼虫,进行初步的抗虫性检测,得到1株具有明显抗虫效果和7株抗虫效果较好的转基因植株.     

小麦5 10亚基基因转化研究

为了获得具有优质亚基基因的小麦转化植株，以豫麦18号和豫麦21号两个基因型的小麦幼胚为受体，利用基因枪法将重组质粒pCAMBIA1301-Sub5 10导入小麦幼胚，分别获得18株和20株再生植株，经PCR检测分别有7株和10株同时扩增到5亚基和10亚基的目标片段，初步表明外源目标基因已整合到小麦的基因组中。     

转GNA基因小麦新株系的分子检测和抗蚜虫性鉴定

为了进行抗蚜虫转基因小麦的研究，将人工合成的雪花莲凝结素(Galanthus nivlis agglutinin．GNA)基因通过基因枪转入优质小麦品种郑州9405的幼胚愈伤组织，经过在选择培养基上多次筛选，从360块被轰击的愈伤组织中再生到1株Bialaphos(除草剂)抗性植株，命名为G郑州9405。通过连续2代对转化株系进行PCR、Southern检测和蚜虫抗性鉴定，证明GNA基因已经整合到了郑州9405基因组中。目前已经获得了纯合稳定的转基因株系，并在河南农业科学院小麦所进行了环境释放试验。     

CryIA(c)基因植物表达载体的构建及转基因甘蔗的获得

构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT 3次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达。     

转抗菌肽B基因和bar基因籼稻植株的再生

 运用基因枪法将含有bar基因和cecropin B基因的质粒pCB1导入籼稻品种特青的幼胚细胞,筛选后得到3株转基因植株。PCR检测和Southern杂交结果表明,外源基因已整合到水稻基因组中。转化当代植株表现出对Basta很强的抗性,同时也增强了对水稻白叶枯病的抗性。     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.     

橡胶树高效农杆菌转化体系的建立

在橡胶（Hevea brasiliensis）花药组织培养和胚性愈伤长期继代增殖技术的基础上,分别以巴西橡胶热研7-33—97品种的花药脱分化愈伤组织和经继代增殖的花药胚性愈伤组织为转化受体,进行橡胶农杆菌转化体系比较研究。结果表明：胚性愈伤组织是更适宜的转化受体。     

狗尾草胚性愈伤高效农杆菌转化体系的建立

狗尾草是研究C4光合作用的优秀模型,具有热带植物的典型特征,也可作为研究热带作物的重要模型,高效的转基因技术是模式植物广泛服务于科研的基础,目前狗尾草作为模式植物的研究在国外越来越热门,但在国内还没有被关注。但作为模式植物狗尾草现有的转化技术还不完善,转化周期有待缩短,转化效率需要进一步提高。本研究以狗尾草ME34品系不同阶段胚性愈伤为外植体进行农杆菌转化体系研究,通过实验大大提高了狗尾草的转化效率,缩短了转化周期,为狗尾草转基因研究提供了新的技术方法,新方法主要包括以下技术环节:高效胚性愈伤诱导技术,受体胚性愈伤的选择,适宜转化的农杆菌株系及培养条件,浸染和共培养条件与方法,抗性愈伤筛选条件,抗性愈伤成苗条件等。     

五种常用的植物转基因技术

从原理、基本步骤和优缺点等几个方面对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍。     

Infection of Early and Young Callus Tissues of Indica Rice BPT 5204 Enhances Regeneration and Transformation Efficiency

A rapid and reproducible method to develop transgenic plants with enhanced transformation efficiency using Agrobacterium has been developed for the elite indica rice variety BPT 5204. Different rice calli aged from 3 to 30 d were co-cultivated with pre-incubated Agrobacterium suspension culture （LBA4404： pSB1, pCAMBIA1301） and incubated in dark for 3 d. Based on the transient GUS gene expression analysis, 6-day-old young calli showed high transformation frequency followed by 21-day-old ones. Thus, both 6-and 21-day-old calli were used for assessing the stable transformation efficiency. It was observed that the 6-day-old young transformed calli showed about 2-fold higher regeneration frequency when compared with 21-day-old calli. The transformation efficiency was enhanced for young calli to 5.9% compared with 0.8% of the 21-day-old calli. Molecular and genetic analysis of transgenic plants （To） revealed the presence of 1-2 copies of T-DNA integration in transformants and it follows Mendalian ratio in T1 transgenic plants. From the present study, it was concluded that the development of transgenic rice plants in less duration with high regeneration and transformation efficiency was achieved in BPT 5204 by using 6-day-old young calli as explants.     

Factors Affecting Agrobacterium-Mediated Transformation Efficiency in Rice

Several important factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated rice transformation were studied with several predominant commercial indica and japonica rice cultivars. As far as indica rice callus was concerned, CC medium was the best and the quality of callus was improved with the addition of 1.0 to 2.0 mg/L ABA. It decreased the percentage of browning calli and improved the callus growing state by addition of a certain amount of sorbitol to the subculture medium. NB medium was the best for callus initiation of japonica rice, but the improvement in the quality of callus of japonica subspecies was not obvious by adding ABA. During the period of subculture, to a certain degree, increasing the sucrose concentration could improve the proportion of hygromycin resistant calli. Furthermore, the transformation efficiency would be higher by applying selection pressure in the selection stage, removing selection pressure during the plantlet differentiation period and applying selection pressure again during seedling hardening period. Besides, suitable combination of plant hormones was beneficial for callus differentiation. An efficient Agrobacterium-mediated rice transformation system had been established for several rice cultivars and a lot of transgenic rice plants had been obtained.     

小麦基因转化研究进展

为了给小麦遗传转化研究提供参考,总结和分析了小麦基因转化的最新研究进展,并针对存在的主要问题提出了今后的研究方向.目前在小麦表达载体构建中普遍采用Ubi和在35S基础上改造而来的启动子序列,使用的报告基因主要有gus、uidA、gfp和Cl/LC等,选择基因主要有bar、nptⅡ、manA(pmi)、Cah、gst27、mopat、popat、CP4和GOX,筛选剂一般选用Bialaphos、Glufosinate、G418和Glyphosate等.小麦基因转化的主要受体为幼胚及其愈伤组织,转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法和农杆菌介导法.受体类型、表达载体序列组成和基因转化方法是影响小麦基因转化效率的主要因素.     

电镜观察农杆菌介导香蕉基因转化的影响因子

用含质粒pBI426的根癌农杆菌EHA105和LBA4404转化香蕉品种威廉斯的叶片、横切薄片及香蕉细胞悬浮系,通过电镜观察农杆菌的附着情况,对香蕉转化早期影响农杆菌与香蕉受体材料相互作用的主要影响因子进行了研究。结果表明:不同的农杆菌菌株对香蕉的遗传转化有影响。EHA105易被乙酰丁香酮诱导,附着在香蕉组织上的量比农杆菌LBA4404的附着量大;乙酰丁香酮是香蕉遗传转化中必不可少的;乙酰丁香酮显著促进了农杆菌的附着量;香蕉横切薄片具有很强吸附农杆菌的能力。     

提高甜菜遗传转化频率的研究

以甜菜叶柄为外植体，通过农杆菌介导转化，将玉米胚乳核糖体失活蛋白基因(cRIP)导入甜菜，对影响转化频率的因素：卡那霉素的浓度、头孢霉素的浓度、农杆菌感染时间和浓度等进行了探讨，初步建立了转化频率较高的转化系统．当卡那霉素浓度为100mg／L，头孢霉素浓度为500mg／L，农杆菌浓度OD值为0.3-0．4，感染时间为8～10min时．抗性不定芽分化率可达36．5％。该转化系统为转基因植株的获得奠定了基础。     

亚麻转基因中抗生素应用效果的研究

在利用农杆菌介导法进行亚麻抗除草剂草丁膦(Basta)目的基因(Bar)导入工作中；对选择培养基内加入．500mg/l克拉维酸钾(timentin进口) 200mg/l头孢噻肟(claforan进口)的抗菌素来取代500mg/l头孢噻肟(Cefotaxime国产)不仅脱菌效果彻底，期效长，且不影响亚麻愈伤形成和芽的分化；同时对再生植株进行了盆栽Basta抗性筛选试验，获得不同抗性的植株和种子。     

油菜的转基因育种

介绍了油菜基因转移的方法,已转移到甘蓝型油菜中的基因,我国已进入中间试验的转基因油菜品系,国外已育成的油菜转基因品种,加拿大种植抗除草剂转基因油菜品种的实践等.并针对油菜转基因育种工作提出几点建议.