小冰麦33温敏抗叶锈性基因分析

小冰麦33是一个高产、高蛋白、抗多种病害的小麦品种,并具有温敏抗叶锈性.为了明确小冰麦33所含有的温敏性抗叶锈基因,选用4个不同毒性基因组合的小麦叶锈菌生理小种在5℃/10℃(黑暗/光照)、15℃/20℃(黑暗/光照)和25℃/30℃(黑暗/光照)三个温度条件下对小冰麦33进行了温敏抗叶锈性基因推导.通过比较3个不同温度下小冰麦33与7个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈近等基因系(分别含有Lr11、Lr13、Lr14a、Lr18、Lr23、Lr34、Lr37温敏基因)对4个小麦叶锈菌生理小种的反应型模式,推导出该品种可能含有Lr18及其他新的温敏抗叶锈性基因.     

Real-time PCR检测大豆CONSTANS基因在不同光照条件下的表达

采用实时荧光定量PCR方法检测了不同感光大豆品种的CO(CONSTANS) 基因在不同光照条件下的mRNA水平变化.结果表明:早熟品种东农49和晚熟品种东农42各自在短日照(8h/16h 光/暗)下会比长日照(16 h/8 h 光/暗)下表达有所增强,同时东农49中CO基因的表达要高于东农42,它们的表达峰值均出现在光暗交界处.东农42由长日照或短日照移入完全光或完全暗条件时,暗下CO基因的表达量剧增,并且大致维持之前长日照和短日照的表达规律.CO基因的表达有很强的昼夜节律性,暗下利于其表达,并且在不同感光品种中表达有所不同.     

温度、光照和土壤含水量对大豆胞囊线虫休眠卵孵化的影响

研究在实验室条件下不同温度,不同光照和不同土壤含水量对大豆胞囊线虫(SCN)休眠卵孵化的影响.分别测定了5个温度梯度下(18℃、21℃、24℃、27℃和30℃),7个光照条件下(0/24 h,4/20 h,8/16 h,12/12 h,16/8h,20/4 h和24/0 h)和7个土壤含水量(1%、5%、10%、15%、20%、25%和30%)条件下SCN休眠卵的孵化情况.结果表明:在供试温度18～30℃之间,休眠卵的孵化总量随温度升高而增加,30℃下孵化数量最大,达1316.33条.全光照处理的孵化量最大,达745.00条,4L/20D、12L/12D和20L/4D次之,而全黑暗处理的孵化量最少,仅为102.00条.土壤含水量在1%～30%之间,含水量为15%时孵化数量最大,达265.33,含水量在1%～15%时,孵化量随含水量的增加而增加,当含水量大于15%时,孵化量随含水量增加反而降低.研究证实在SCN休眠期可以通过提高温度增加光照时间来诱导卵孵化,以提高J2孵化数量,采用休眠胞囊接种应注意调节土壤含水量.     

台盼蓝染色鉴定拟南芥sdl1突变体的细胞死亡

拟南芥突变体sdl1在光周期为16 h黑暗/8 h光照条件下生长叶片出现先萎蔫后白化现象,采用台盼蓝染色的方法研究萎蔫及白化苗的死亡情况,结果证实突变体sdl1萎蔫处发生细胞死亡,但细胞完全死亡（完全白化）后不能被染色,所以台盼蓝染色只能对突变体sdl1细胞死亡的早期进行鉴定。     

蓝光连续光照对大豆芽苗菜类黄酮合成的影响

以黑暗培养(D)为对照,阐明了蓝光(B)连续光照对大豆(Glycine max L.Merr.)芽苗菜品种东农690生长和类黄酮合成的影响。结果表明:与对照组相比,蓝光连续光照36 h显著提高了大豆芽苗菜子叶中山奈酚(kaempferol)和黄豆苷元(daidzein)的含量,同时子叶中蓝光光受体基因CRY1、CRY2,类黄酮合成相关基因IFS的表达量也显著提高。处理组中,大豆芽苗菜下胚轴中黄豆苷(daidzin)含量逐渐增加,黄豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、染料木苷(genistin)和山奈酚(kaempferol)的含量先升高后下降,但在36 h时均显著高于黑暗处理。在蓝光光照6和24 h时,大豆芽苗菜下胚轴中苯丙氨酸解氨酶(PAL)与查尔酮异构酶(CHI)活性与对照组相比均显著提高。类黄酮合成途径相关基因PAL、CHS、ANS、IFS的表达量在蓝光处理下均是先升高后下降,而蓝光光受体基因CRY1与CRY2的表达量随着光照时间延长逐渐升高。     

长日照条件下玉米开花期光反应相关基因差异表达模式分析

以Suwan种质代表性自交系T32（光敏感）和QR273（光钝感）为材料，利用实时qRT-PCR方法研究10个光反应相关基因在长日照条件下（16 h光照/8 h黑暗）的差异表达模式。结果表明，长日照条件下，不同光反应相关基因在不同自交系间表现出震荡表达模式，其中，开花促进基因ZmCOL、ZmELF4、ZmGI、ZmHd1、ZmHd6、ZCN8在光钝感系QR273中的相对表达量显著高于光敏感系T32；开花抑制基因ZmCCT9、ZmCCT10的相对表达量则显著低于T32。此外，ZmTFL1与ZmCCT虽为开花抑制基因，但其在光钝感自交系QR273中显著高表达，而在光敏感自交系T32中则低表达。     

茶多酚对农杆菌介导的植物遗传转化体系的影响

为研究在农杆菌介导的茶树遗传体系中,茶多酚对农杆菌侵染效率的影响,以LBA4404、EHA105、ATCC15834和K599 4个农杆菌菌株为研究对象,分析其在不同浓度茶多酚处理下的耐酚能力、被膜完整率、吸附性、vir和chv基因表达,以及遗传转化差异。结果显示,4个菌株的耐酚能力依次为LBA4404>K599>EHA105>ATCC15834,其中EHA105和ATCC15834菌株对茶多酚较为敏感;ATCC15834菌株被膜完整率与茶多酚的浓度、静置时间呈负相关,EHA105在600 mg·L^-1茶多酚处理48 h后,其被膜完整率最低;ATCC15834和EHA105对烟草叶肉细胞的吸附能力随着茶多酚浓度的升高而降低,在经茶多酚处理24 h后,ATCC15834中chvB和EHA105中chvB2的表达受到显著抑制,virA表达量与低浓度酚类的敏感性呈正相关性;烟草经农杆菌菌液（含茶多酚）侵染后,瞬时转化效率和稳定转化效率均受到不同程度的抑制,发状根诱导率大大降低。1 000 mg·L^-1茶多酚处理后,ATCC15834的发根诱导率最低,仅为13.85%,坏死率高达33.85%。综上所述,茶多酚会降低农杆菌活力和被膜完整率,chv基因通过降低表达量影响其吸附性,最终导致烟草转化体系中瞬时转化效率和稳定转化效率均受到不同程度的抑制。     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。     

人胰岛素样生长因子-I基因转化葡萄的研究

以根癌农杆菌介导的叶盘法转化技术将huIGF-I基因转入葡萄组织细胞,并通过既成的再生-转化体系诱导筛选huIGF-I转基因葡萄植株,在抗性筛选中使用卡那霉素浓度为(Kan.)40mg/L,使用的根癌农杆菌工程菌株为EHA105/pBIGF-I、EHA105/pCIGF-I。最后用PCR技术、Southernblot对转基因植株作分子鉴定,其检测阳性率分别为60%和66.6%。     

STE20L4促进拟南芥下胚轴伸长的机制研究

下胚轴伸长是高等植物进行正常生命活动的保障,下胚轴的伸长协助植株破土而出并由异养转变为自养生长。本研究通过对一系列拟南芥突变体材料进行下胚轴观察,鉴定到一个具有短下胚轴的突变体ste20l4,并对其调控下胚轴伸长的分子机制进行初步探索。结果表明：STE20L4编码与酵母中STE20同源的丝裂原活化蛋白激酶,在MAPK级联信号通路中作为MAP4K激活下游的MAP3K。基因型鉴定和半定量结果显示,ste20l4-1、ste20l4-2均为功能缺失的突变体。通过表型观察,ste20l4突变体无论在长日照（16 h光照/8 h黑暗）、短日照（8 h光照/16 h黑暗）及黑暗（24 h黑暗）条件下与野生型相比均呈现出短的下胚轴。细胞学结果显示,突变体ste20l4短的下胚轴是由于其细胞长度的变短而不是细胞数目的变化导致的。植物激素赤霉素可促进下胚轴的伸长,对其处理的敏感性可作为是否参与GA信号转导途径的判断方法。在不同梯度浓度的GA处理（0、0.5、1、2、5 µmol/L）下,ste20l4突变体与野生型相比下胚轴伸长作用不明显。多效唑（PAC）是内源GA合成的抑制剂,随着不同梯度浓度的PAC处理（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µmol/L）,ste20l4突变体下胚轴伸长的抑制作用相对于野生型不明显。上述生理学结果表明,STE20L4参与到GA信号转导通路中调控拟南芥下胚轴的生长发育。将STE20L4蛋白与荧光标签融合后转染烟草或拟南芥原生质体观察其亚细胞定位,结果表明STE20L4在细胞膜和细胞质中均有表达。对野生型、ste20l4突变体中进行一系列GA下游与下胚轴伸长相关基因的RT-qPCR检测,结果表明XTH17、EXP2、PRE1、PIF4、YUC2和SAUR19基因的转录水平在ste20l4突变体中明显下调,即STE20L4可能通过间接调控这些下游基因的表达参与下胚轴的伸长。综上,STE20L4参与GA信号转导通路,且通过促进GA下游下胚轴伸长相关基因的表达调控下胚轴的伸长。本研究初步阐述了STE20L4调控植物下胚轴伸长的分子机制,为进一步研究MAPK与GA互作调控植物生长发育提供参考。     

不同基因型大豆愈伤组织对农杆菌EHA105的敏感性研究

研究了8个基因型的大豆愈伤组织GUS瞬时表达的效果及其最佳染色条件,以考察不同基因型大豆愈伤组织对农杆菌菌株EHA105的敏感性.GUS染色结果表明:不同品种对农杆菌EHA105敏感程度差别较大,吉林47和东农42愈伤GUS染色效果较好;不同品种要求的最佳染色时间存在差异,对农杆菌EHA105较敏感的2个基因型吉林47...     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料，利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段，将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序，结果证明，此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间，构建了植物表达载体pBIFe，并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。     

番木瓜环斑病毒CP基因同源区段的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术对番木瓜环斑病毒CP基因的同源区段进行了克隆和鉴定分析。序列分析结果表明,获得PRSV-CP基因3′端的278bp DNA片段同源率最高。构建了目的基因包含278bp正义链、内含子(PDK内含子)及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,并通过电激法导入农杆菌中。经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入获得了农杆菌工程菌株。利用该植物表达载体对番木瓜的遗传转化工作目前正在进行中。     

根癌农杆菌介导茶树转化研究

通过检测GUS瞬间表达 ,对影响根癌农杆菌侵染茶树叶片效果的若干因素进行研究。Kan对茶树叶片愈伤组织形成的抑制浓度在 3 0mg/L左右 ,因而对以Kan为筛选标记的载体来说 ,5 0mg/LKan是较为适宜的选择浓度。茶树较为适宜的农杆菌转化系统是用OD6 0 0 为 0 5 - 0 8的LBA4 4 0 4侵染 10分钟左右 ,暗中2 8℃共培养 2 - 3天。硝酸银对农杆菌生长有抑制作用 ,不宜在共培养阶段添加     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

亚麻转基因植株的再生及生根培养的研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体 ,利用抗除草剂 Basta的目的基因和 GUSINT基因 ,采用农杆菌介导法进行了亚麻转基因过程中植株再生及生根适宜培养基的筛选试验。经试验得出 :在附加少量 BA和 NAA的 Ms培养基上愈伤组织的再分化率可达31.8%～ 40 .2 %。经 GUS基因检测在脱菌后 3天亚麻下胚轴初步形成的愈伤组织的转化率可达 72 .2 %;四周后的转化率为 2 5 %;再生植株的转化率为 2 0 %。在 1/2 Ms培养基中附加 0 .0 0 1mg/L NAA可使再生植株的生根率达到 87.4%。通过试验初步建立起了根瘤农杆菌介导法亚麻转基因系统。     

利用农杆菌介导法进行亚麻转基因的培养基研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体进行了卡那霉素选择压力的试验。确定5 0mg/L为适宜的选择压力。同时采用农杆菌介导法 ,利用EHA1 0 5菌株进行了亚麻转基因适宜培养基筛选试验。经试验认为MS培养基是亚麻转基因的适宜培养基。在附加IAA3.5mg/L、KT2mg/L、LH1 5 0mg/L的MS选择培养基上转化外植体的愈伤组织的诱导率可达 77.4%。