菠萝SVP基因对乙烯利刺激的响应

SVP（short vegetative phase）是一类开花抑制基因,通过调节开花相关基因的表达,影响植物从营养生长阶段向生殖生长阶段的转变进程。根据公布的菠萝基因组信息,从‘台农4号’菠萝中克隆到2个AcSVP基因AcSVP1和AcSVP2。结果表明：AcSVP1和AcSVP2分别编码225和230个氨基酸,均含有MADS-box、K-box保守结构域,二者所编码蛋白均属MADS-box基因家族成员。定量PCR分析结果显示,2个AcSVP基因在菠萝茎尖、茎基和叶中均有不同程度的表达,乙烯利处理后主要表现为下调。乙烯利处理8 h内,AcSVP1在茎尖、叶中的表达显著下调,但在茎基组织中呈现先下调后上升的趋势;乙烯利处理后8 h,茎基组织中AcSVP1的相对表达量略高于对照。与AcSVP1不同,乙烯利处理8 h内AcSVP2在茎尖、茎基、叶3种组织中均明显下调;乙烯利处理后8 h,AcSVP2在茎尖、茎基、叶组织中的相对表达量只有对照的8%、44%和33%。SVP是目前已知的最重要的一类开花抑制基因,AcSVP在响应乙烯利的过程中表达显著下调,表明其在乙烯利诱导菠萝成花过程中可能发挥重要作用。     

龙眼HD-Zip基因家族生物信息及表达分析

为了解龙眼HD-Zip基因家族的功能,本研究基于龙眼基因组与转录组数据库,对提取的19个龙眼HD-Zip家族成员的启动子、可变剪接以及受到调控的miRNA种类进行分析;并采用实时荧光定量PCR技术,分析了在ABA处理下龙眼胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中HD-Zip部分成员的表达模式,以及HD-Zip部分成员在不同体胚阶段的表达模式。结果表明：龙眼HD-Zip家族除含有TATA-box和CAAT-box以外还含有大量的光响应元件、激素响应元件以及胁迫响应元件,暗示龙眼HD-Zip家族成员可能参与光反应、激素响应以及非生物胁迫的过程;龙眼HD-Zip在不同组织部位与不同体胚阶段的可变剪接方式主要以内含子保留为主;龙眼HD-Zip基因家族成员主要受到miRNA166a的调控;在外源激素ABA处理下龙眼EC中HD-Zip家族部分成员的表达模式以及部分成员在不同体胚阶段的表达模式都呈现多样化,推测龙眼HD-Zip参与龙眼不同体胚发育的调控,并且可能通过调节内源ABA的浓度进而影响胚性愈伤组织的生长发育以及形态的建成。     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因（HbACO7）的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析

小热激蛋白（small heat shock protein, sHSP）是一类胁迫诱导蛋白,不仅参与植物发育还响应生物与非生物胁迫。本研究通过分析转录组数据获得橡胶树12个sHSP基因家族成员。生物信息学分析和表达谱分析结果表明：蛋白保守结构预测显示12个sHSP均具有α-晶体蛋白保守结构域;二级结构预测结果显示,12个sHSP均由α-螺旋、β-转角、延伸链和大量的随机卷曲组成。通过RT-PCR技术分析,结果发现这12个sHSP家族基因在橡胶树不同组织和叶片不同发育时期中表达有明显差异,HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.5、HbsHSP22.6和HbsHSP23.9在胶乳中高表达,HbsHSP17.4在树皮中高表达,HbsHSP17.5a在树茎中高表达,HbsHSP25.8则在树叶中表达量最高。乙烯利处理后,12个sHSP家族基因的表达总体呈下降趋势。在不同死皮等级橡胶树中12个sHSP家族基因的表达也具有明显差异,与健康树相比,HbsHSP15.8、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.6、HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在死皮树中的表达量呈下降趋势;HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和HbsHSP22.5的表达量呈上升趋势。因此推测橡胶树sHSP家族基因可能参与橡胶树生物与非生物逆境胁迫响应,以及可能在乙烯作用途径中发挥作用。     

龙眼MSIL全基因组鉴定及表达分析

MSIL（Muliticopy suppressor of IRA homolog1-Like）基因是WD重复蛋白的一个亚家族,在植物生长发育过程中发挥重要的作用。为了解龙眼MSIL（DlMSIL）基因家族的生物学功能,本研究基于基因组和转录组数据,采用生物信息学分析法对DlMSIL基因成员进行鉴定,并进行蛋白质结构及理化性质分析、系统发育进化树构建、启动子顺式作用元件分析、龙眼体胚阶段和不同组织器官表达情况以及GA₃处理下的定量表达分析。结果表明：DlMSIL基因家族含有6个成员属于WD40和CAF1C_H4-bd超家族,可分为3类;DlMSIL蛋白编码393~551 aa,等电点为4.68~7.62,该家族成员均不属于分泌蛋白;基因家族成员的内含子数目在4~14之间;DlMSIL启动子序列包含大量非生物胁迫响应元件及MYB结合位点,推测DlMSIL基因家族可能参与多种非生物胁迫反应;DlMSIL可能参与不同胚胎的发育过程和不同组织器官的形态建成。GA₃处理下的表达分析显示高浓度时,DlMSI1a与DlMSI1c的表达受到了一定的抑制,而DlMSI4a的表达量呈现先下降后上升再下降的趋势,推测DlMSIL可能参与激素响应途径。本研究表明,DlMSIL基因家族成员可能参与胚胎发育、激素信号通路以及非生物胁迫反应等多种生物学功能,体现了龙眼MSIL基因家族功能具有多样性。     

龙眼DCL4的亚细胞定位分析及其对外源ABA和SA的响应

为了研究DlDCL家族中DlDCL4基因在龙眼中的功能,本研究通过氨基酸序列比对、系统发育进化树的构建、亚细胞定位验证、实时荧光定量PCR（qPCR）等方法,对其进行初步探究。结果表明：遗传进化分析显示,DCL4氨基酸序列在所选的物种间相似度高于50%,其中龙眼与甜橙（Citrus sinensis）的亲缘关系最近。在激光共聚焦显微镜观察下,洋葱细胞核发出绿色荧光,其他部位不发出荧光,表明龙眼DCL4蛋白定位于细胞核中。在24 h内,100 μmol/L的外源脱落酸（ABA）对 DlDCL4都有极显著的下调效果;100 μmol/L的水杨酸（SA）对其表达量有显著的上调效果,其中8 h时表达量最大,提示 DlDCL4对不同激素的响应效果不同且不同处理时长下响应效果也会有影响。     

龙眼体胚发生过程中RNA甲基化相关基因全基因组鉴定及表达分析

为了解龙眼RNA甲基化相关基因的生物学功能,本研究基于基因组和转录组数据,采用生物信息学分析方法,进行龙眼基因组RNA甲基化相关基因成员鉴定,蛋白结构域及特性分析,分子进化树分析,体胚发生过程和组织器官基因表达水平分析以及ABA处理下的定量表达分析。结果显示：龙眼中有7个参与RNA甲基化过程中的关键基因,包括5个RNA甲基转移酶基因和2个去RNA甲基化酶基因;各成员内含子数量差别较大,为4~28个不等;进化树分析显示,龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白与甜橙亲缘关系最近;蛋白结构域分析显示,RNA甲基化相关酶具有保守的蛋白结构域;龙眼RNA甲基化相关基因启动子区域中主要含有光响应功能元件、激素响应功能元件、胁迫响应功能元件和分生组织表达响应元件,推测RNA甲基化相关基因可能对植物的生长发育和适应不良环境有一定调节作用;RNA甲基化相关基因部分成员在龙眼体胚不同发生阶段和不同组织器官中的表达有明显区别,推测龙眼RNA甲基化相关基因可能参与不同体胚发育阶段和组织器官形态建成;不同浓度ABA处理下,龙眼EC中RNA甲基化相关基因的表达情况各异,其中DlVIR、DlALKBH10B和DlMTB的相对表达量受到一定的抑制作用,而DlFIP37则呈现上调表达,暗示龙眼RNA甲基化相关基因参与激素响应途径。本研究表明,龙眼RNA甲基化相关基因除了可能在叶的形成、花的发育和植株的形态建成等方面发挥重要的作用外,还可能参与调控胚胎发育和响应非生物胁迫,推测龙眼RNA甲基化相关基因成员在功能上具有差异性和多样性。     

龙眼体胚发生早期4CL基因家族鉴定与功能分析

为了解龙眼4-香豆酸：辅酶A连接酶（Dl4CL）基因家族的分子特性及生物学功能。采用生物信息学分析方法进行龙眼4CL基因家族的成员鉴定,蛋白结构域及特性、分子进化树、体胚发生过程和组织器官中的表达规律分析以及可能互作的miRNA预测。结果显示,Dl4CL基因家族包含43个成员,分为6个亚家族;不同亚家族成员的基本理化性质包括等电点、相对分子量、氨基酸个数及信号肽有所差别;Dl4CL蛋白均属于非分泌型蛋白,具有多个保守的motif;各成员基因结构特性与进化树中家族成员亲缘关系的远近有关;Dl4CL启动子序列包含大量光响应元件、厌氧诱导响应元件及MYB结合位点,推测Dl4CL家族成员可能参与龙眼生长发育过程中黄酮类物种的生物合成以及色素的积累;Dl4CL可能参与不同胚胎发育过程和不同组织器官的形态建成;43个Dl4CL成员共有10个受miRNA调控,并且不同成员受不同的miRNA靶向调控,推测Dl4CL可能通过与miRNA互作参与体胚发生、响应环境胁迫等过程。研究表明,Dl4CL在龙眼体胚发生早期除了参与木质素的合成之外,还可能参与色素合成、组织器官特异表达等多种生物代谢途径,表现其生物学功能的复杂性。     

龙眼类受体蛋白激酶CRK家族全基因组鉴定及表达调控分析

为了解龙眼富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶（cysteine-rich receptor-like kinase,CRK）家族的基本特征与功能,本研究采用生物信息学分析方法对筛选出的98个龙眼CRK基因家族的成员进行分析鉴定,包括分子进化树的构建和对蛋白结构域及其特性、启动子及其顺式作用元件、体胚发生的过程以及组织器官特异性表达的分析。结果显示：通过对龙眼和拟南芥CRK基因做进化树分析,可根据亲缘关系的远近将其分为7个亚家族;不同亚家族成员的蛋白质特性（氨基酸数量、相对分子质量、等电点、信号肽及糖基化位点）有所不同;各成员基因结构特性,启动子顺式作用元件,蛋白结构域特性等与进化树中家族成员亲缘关系的远近相关;98个CRK家族成员在体胚发生过程（NEC、EC、ICpEC、GE）以及生长发育过程中组织器官特异性表达情况有所不同,其中在非胚性愈伤组织以及幼果中表达量较高,在种子和果实中几乎未表达。此外,富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶在生物胁迫、非生物胁迫（抗病虫害、抗旱、抗寒、抗盐胁迫等）以及在植物生长发育过程中起着重要作用。     

菠萝COL基因的克隆及响应乙烯的表达特性分析

COL（CONSTANS Like）基因不仅响应光周期调控,还参与植物器官的发育及非生物胁迫的响应。本研究克隆了4个菠萝COL（AcCOL）同源基因,预测其蛋白的结构理化性质和启动子顺式作用元件,并探究AcCOL基因在乙烯利处理后的时空表达模式。结果表明：AcCOL1、AcCOL2基因分别编码387、243个氨基酸,都含有CCT结构域,属于第Ⅳ类COL基因;AcCOL3、AcCOL4基因分别编码394、411个氨基酸,均含有1个B-box和1个CCT结构域,属于第Ⅲ类COL基因。启动子顺式作用元件预测表明4个AcCOL的启动子中均含有光响应元件、昼夜节律表达相关元件。AcCOL1和AcCOL2启动子均含有生长素响应元件和乙烯响应元件;AcCOL3和AcCOL4启动子均含有细胞分裂素响应元件。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcCOL基因主要在叶中表达。乙烯利处理后,4个AcCOL同源基因均有不同程度上调。与各自时期的对照相比,AcCOL1和AcCOL4在茎中表达上调较多;AcCOL2和AcCOL3在叶中表达上调较多。另外,AcCOL2基因在3个组织部位中与各自时期的对照相比均有显著上调。研究表明,4个AcCOL同源基因在乙烯利处理后,表达水平均有上调;其中AcCOL2更为显著,在3个组织部位中,与另外3个基因相比表达上调更多。说明AcCOL2基因对外施的乙烯利信号更加敏感,可能在乙烯作用途径中发挥作用。     

龙眼DlICE1基因克隆及低温胁迫表达分析

本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料,根据龙眼转录组数据库,采用RACE-PCR和RT-PCR技术获取龙眼DlICE1 cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析与低温胁迫下表达分析。结果表明,龙眼DlICE1 cDNA全长为2327 bp,其中开放式阅读框（ORF）序列长1614 bp,共编码537个氨基酸。生物信息学分析表明,龙眼DlICE1编码的蛋白质属于不稳定的弱酸性蛋白,不具有典型的信号肽,且不属于分泌蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,与甜橙的同源蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR表明,龙眼DlICE1能够有效响应低温胁迫,低温诱导其表达量提高。研究结果显示,龙眼DlICE1基因参与龙眼胚性愈伤组织抗寒过程。     

龙眼体细胞胚胎发生早期SDG基因家族的全基因组鉴定与表达分析

SET domain group（SDG）基因家族控制的组蛋白赖氨酸甲基化,是参与染色质功能调控和表观遗传调控基因表达的重要部分。为了解龙眼（DlSDG）家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼全基因组SDG家族成员的鉴定,并对蛋白质结构域、保守基序、基因结构、启动子顺势作用元件、进化树、相关基因的蛋白互作和体胚发生早期的基因表达情况进行预测和分析。结果显示,龙眼SDG家族基因包括32个成员,分为Suv、Ash、ATXR5/ATXR6、Trx、E(z)、SMYD和SETD 7个亚家族,其中Suv亚族成员数量最多;外显子数量在1~22个不等,蛋白结构域保守,都含有一个SET结构域,DlSDG蛋白保守motif不同亚家族间差异较大;DlSDG启动子包含许多诸如低温、干旱和压力等非生物胁迫响应元件和激素响应元件;龙眼SDG成员在体胚发生早期均能不同程度表达,其中DlSUVR4b在EC和ICpEC阶段可能发挥着较为重要的作用;DlSUVH4可以和DNA甲基转移酶MET1发生互作。本研究表明,龙眼DlSDG 32个组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因可能除了在生物钟的调节、植物发枝数量、根的生长发育、种子的萌发、花的发育和植株的形态建成等方面发挥重要功能外,也可能直接参与胁迫响应和体细胞胚胎发生的调控,并且还可能在参与DNA甲基化、染色质重塑的过程中形成体细胞胚胎发生的协作调控网络,表现其具有功能上的多样性、复杂性。     

龙眼LEAFY同源基因片段的克隆和表达

研究克隆的龙眼（Dimcarpus Longan Llour.）LFY同源基因（LFY）保守区片段在不同组织器官以及"冲梢"逆转成的营养芽中的表达情况,为进一步鉴定龙眼LFY同源基因的功能及分析其在龙眼花序的冲梢"过程中的作用机理奠定基础。根据不同物种LEAFY同源基因保守区序列设计简并引物,从 红核子"龙眼（D.longan Lour.cv.Red Seed）中克隆了425bp的cDNA片段。同源性比较结果表明,获得的序列为龙眼LEAFY 同源基因（LLFY）;同时还获得了1816bp的LLFY基因组序列片段并进行了序列分析。通过RT-PCR研究LLFY在6种龙眼不同组织器官的表达发现LLFY在花序芽和花芽中的表达量最高,叶芽中有微量表达,叶片和茎段中没有表达;在冲梢"逆转成的营养芽中,LFY的表达量明显高于叶芽     

龙眼DlWRKY52基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物的生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。前期研究发现,部分WRKY基因（比如DlWRKY52）参与了龙眼的成花诱导和逆境胁迫响应过程。为进一步研究龙眼WRKY基因的功能,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板克隆得到DlWRKY52基因,并对其序列特征、组织表达模式、花果发育过程表达模式及亚细胞定位进行研究。结果表明：DlWRKY52基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）全长为918 bp,编码306个氨基酸,具有典型的WRKY结构域和锌指结构,属于Ⅱc型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明,DlWRKY52基因在叶片、茎和果实器官中高表达;在花后80 d的果肉中显著上调表达;特异在‘四季蜜’成花诱导中下调表达。拟南芥原生质体瞬时表达结果显示,荧光信号主要集中在细胞核。上述结果表明,作为典型的转录因子,DlWRKY52编码的蛋白定位于细胞核。DlWRKY52可能参与了龙眼成花诱导及果实早期发育调控。     

龙眼Mn-SOD基因的表达及其启动子功能分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况,并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明:龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制;而在白光处理下,Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势,在绿光中,则是先下调再上升。在盐胁迫处理下,Mn-SOD基因的表达受到抑制,在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内,外源激素IAA、GA3、Me JA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达,提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明,龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于Ca MV35S启动子,但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示,3’缺失的MSD-pro4(-669~-267 bp)启动GUS基因的能力最强,其次为5’缺失的MSD-pro1(-669~-1 bp),最弱的为MSD-pro2(-432~-1bp)和MSD-pro3(-267~-1 bp),提示Mn-SOD启动子-669~-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件;而-432~-1 bp区段含有负调控元件。