大豆涝渍响应NAC基因的鉴定及GmNAC038的克隆和激素应答分析

NAC是植物特有的转录因子,参与多种非生物胁迫的响应.为了研究NAC转录因子在大豆涝渍胁迫中的响应和调控作用,利用前期获得的耐涝品种齐黄34在涝渍胁迫下的转录组数据,通过分析大豆全基因组内180个NAC基因的表达情况,鉴定出45个持续响应涝渍胁迫的大豆NAC基因.利用PlantCARE在线软件分析发现这些基因的启动子中均至少含有1种逆境或激素应答元件,推测它们可能与大豆的非生物胁迫应答相关.同时,对涝渍胁迫响应程度最大的大豆NAC基因GmNAC038进行克隆和分析.利用在线分析软件CDD分析发现该基因编码的蛋白质含有保守的NAM结构域.qRT-PCR表明GmNAC038不仅受到涝渍胁迫的强烈诱导,还受到脱落酸、乙烯和茉莉酸甲酯的正向调控.研究结果可为今后探索NAC基因在大豆涝渍胁迫响应中的功能提供分子基础,为培育耐涝大豆品种提供基因资源.     

大豆GmNAC115基因克隆及特征分析

NAC转录因子在植物发育和逆境应答中具有重要的作用。本研究从大豆中克隆了1个NAC基因GmNAC115。该基因c DNA全长1 383 bp,开放阅读框长912 bp,编码303个氨基酸,预测分子量约为34.278 k D,p I8.37。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。Gm NAC115基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析发现Gm NAC115和Pv NAC为1个分支。转录活性分析结果表明,Gm NAC115转录因子具有转录激活功能。SDSPAGE电泳分析表明,p ET-28a-Gm NAC115最佳诱导表达条件为在37℃下1.0 mmol·L-1IPTG诱导2 h。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中Gm NAC115都有表达,在根中表达量最高,在种子中表达量最低。     

大豆转录因子GmNAC8的克隆及耐旱性功能分析

大豆转录因子GmNAC8在耐旱材料和敏感材料中明显差异表达,该基因CDS序列全长1 092bp,编码363个氨基酸残基。通过软件预测,蛋白质相对分子质量为41.82k D,等电点为8.51,其N-端含有42aa组成的NAC保守结构域,C-端高度变异。进化树分析表明,该蛋白与菜豆、红豆、绿豆同源关系最近。在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析表明GmNAC8蛋白定位于细胞核。转录水平表达分析表明,GmNAC8基因在转基因株系叶中的表达量要明显高于根中的表达量;GmNAC8基因受0.1mmol/L IAA和ABA诱导表达量显著上升,受GA和SA抑制。GmNAC8基因在拟南芥中超量表达可以使拟南芥叶片更绿,耐旱能力增强。抗旱生理指标检测表明,在干旱处理10d后,转基因拟南芥叶中蛋白质含量、脯氨酸含量、POD活性均高于野生型拟南芥,丙二醛含量明显低于野生型拟南芥,仅为42%。本研究结果为进一步研究GmNAC8在植物耐旱反应中的分子机理奠定基础。     

大豆Usp1基因的克隆和表达分析

在对大豆根系盐胁迫抑制差减杂交文库EST序列分析的基础上,利用RT-PCR技术克隆得到了一个大豆Us-pA基因,命名为GmUsp1,其编码一个包含164个氨基酸残基的多肽链。多序列比对和编码蛋白结构分析表明,GmUsp1属于泛应激蛋白(Universal Stress Protein)家族成员之一。其氨基酸序列与蚕豆Vf_enod18序列相似度最高,属于MJ-0577类中含有ATP结合位点的UspA亚族,与MJ-0577有相似的蛋白二级结构。分别采用250 mmol.L-1NaCl、100μmol.L-1ABA和30%PEG 6000进行胁迫处理,耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union的GmUsp1均被诱导表达,二者对胁迫诱导响应时间和表达量存在差异,说明GmUsp1可能参与大豆对非生物逆境胁迫的应答调控。     

大豆Glyma.05G222700.2基因生物信息学与逆境表达分析

为研究Glyma.05G222700.2基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在抗非生物胁迫过程的功能和原理,促进大豆抗逆候选基因的开发利用,本研究通过生物信息学方法对大豆Glyma.05G222700.2基因进行同源序列、蛋白结构、进化树和转录组分析,通过qRT-PCR分析盐胁迫下大豆不同组织中该基因的表达情况。结果表明:该基因编码区长2 040 bp,编码697个氨基酸,预测分子量为656.54 kD,pI8.026。多序列比对发现Glyma.05G222700.2蛋白包含1个Pkinase结构域。进化树分析表明该蛋白与野大豆、刺毛黧豆、赤豆一致性较高。转录组数据表明Glyma.05G222700.2基因在大豆各组织中均有表达,其中在种子中表达量最高,在根中表达量最低。qRT-PCR结果发现Glyma.05G222700.2基因在毛状根、茎、叶中均有表达,在茎中表达量最高,在叶中表达量最低;在毛状根中盐胁迫12 h表达量达到极值,盐胁迫24 h表达量下降;在茎中表达量呈上升趋势,在24 h表达量达到极值;在叶中表达量不稳定,盐胁迫2 h该基因不表达,盐胁迫6 h该基因表达量达到极值并高于对照,盐胁迫12和24 h表达量低于对照。推断该基因可能在大豆抵抗盐胁迫过程中起到重要作用。     

玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1 992 bp,开放阅读框为2 352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。     

大豆GmMADS基因的克隆及表达分析

为了探究大豆MADS-box编码基因在生物和非生物胁迫中的调控作用,以SMV抗感大豆品种为试验材料,从大豆中克隆GmMADS基因Glyma.02g121500,进行生物信息学分析和表达特点分析,同时检测不同逆境胁迫下GmMADS基因表达量变化情况。结果表明:GmMADS基因完整ORF长度为735 bp,编码244个氨基酸,pI 6.68,相对分子质量为28.2 kD。抗感品种间基因CDS序列存在1个SNP差异,氨基酸序列无差异。启动子序列包含防卫和胁迫响应元件、植物激素应答元件、光应答元件等许多顺式作用元件。GmMADS与木豆、花生、豇豆、羽扇豆等物种中的同源基因亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示GmMADS在细胞核上表达。组织特异性表达分析显示GmMADS在花中的表达量最高。接种大豆花叶病毒后,抗病品种科丰1号GmMADS在2 h表达最高且显著高于感病品种南农1138-2;低温胁迫时,GmMADS表达在2 h上调;盐胁迫时,GmMADS表达在1 h下调;干旱胁迫时,GmMADS表达在2 h下调。本研究对下一步分析该基因功能、阐明该基因在调控大豆抗病和耐逆的分子机制具有重要意义。     

大豆GmNCED5基因非生物胁迫响应及生物信息学分析

为探究大豆9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)基因GmNCED5对非生物胁迫的响应及原理,为植物基因工程及大豆抗逆育种提供理论基础,本研究检测GmNCED5在非生物胁迫下的表达量,并对该基因及其启动子序列进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR结果显示,干旱、高盐、高温、低温及外源脱落酸(ABA)处理均可以不同程度地诱导GmNCED5在大豆幼苗中表达.GmNCED5基因开放阅读框(ORF)全长1 686 bp,编码561个氨基酸.亚细胞定位预测结果显示,GmNCED5蛋白主要定位于细胞质中.系统进化分析表明GmNCED5蛋白与豇豆VuNCED蛋白的亲缘关系最近.启动子预测分析结果显示,GmNCED5启动子区域含有5种激素响应相关顺式作用元件和3种胁迫响应相关顺式作用元件.由此推测GmNCED5可能通过启动子区域的顺式作用元件响应非生物胁迫.     

外源硅对逆境胁迫下大豆抗逆相关转录因子表达的影响

为探究外源硅对逆境胁迫下大豆转录因子的表达模式,分析大豆晋豆37号幼苗在盐、干旱胁迫和外源硅作用下NAC家族GmNAC2、GmNAC3、GmNAC4、GmNAC5以及WRKY家族GmWRKY1、GmWRKY25、GmWRKY38、GmWRKY54转录因子的表达情况。结果表明:在盐、干旱逆境胁迫下,大豆植株生长受抑制,与对照相比,逆境胁迫下的植株鲜重、干重、株高、叶片数、叶片相对含水量均不同程度下降,而加入外源硅后这些指标较单独胁迫明显升高。NAC家族和WRKY家族的8个转录因子在大豆叶、茎和根系均有表达,在盐、干旱胁迫下,GmNAC2、GmNAC3、GmNAC4、GmNAC5以及GmWRKY1、GmWRKY25、GmWRKY38、GmWRKY54的表达量明显低于对照,而在胁迫下加入外源硅后其表达量明显比单独胁迫高,且随逆境胁迫时间延长,转录因子的表达量变化趋势基本一致,不同处理时间单独施加硅处理和对照无显著差异。说明外源硅能够在盐、干旱逆境胁迫下影响大豆相关转录因子的表达。     

大豆RNA依赖的RNA聚合酶基因GmRDR1的克隆与表达特性分析

为了寻找大豆抗病新基因,培育大豆新型抗性品种,利用同源克隆的方法从大豆品种科丰1号中分离出1个新的GmRDR1基因,并对其进行序列分析,组织表达、抗逆境胁迫表达分析及该基因的亚细胞定位研究。结果表明:GmRDR1基因位于大豆基因组的第2号染色体,基因全长为3 956 bp,其中ORF为3 378 bp,编码1 125个氨基酸,相对分子量和等电点分别为279.72×103和4.63;GmRDR1含有RDRs家族的保守序列"DLDGD";该基因在所有被检测组织中均表达,并且在叶中的表达量最高;荧光定量结果发现:在大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)处理下,GmRDR1在抗病材料科丰1号中的表达量显著高于感病材料南农1138-2。盐及干旱胁迫下,48 h之内,该基因的表达量明显升高,SA诱导条件下该基因在6 h出现了早期响应,冷害处理下24 h表达量出现了突然的升高。GmRDR1基因的亚细胞定位结果表明:该基因所编码的蛋白定位在细胞核里。根据以上结果判定GmRDR1基因参与了大豆对SMV的抗性反应,并且能够强烈响应盐和干旱的胁迫,因此该基因在大豆抗逆分子育种中具有较好的应用价值。