转精氨酸酶基因ZmARG玉米后代株系的遗传稳定性分析和功能验证

以T4、T5代转ZmARG基因玉米株系AKF65和受体自交系KF513为试材,对目标基因的整合表达、酶活性及产量相关农艺性状进行检测。结果表明,PCR、Southern和RT-PCR检测证明,ZmARG基因以单拷贝的形式插入基因组,在转录水平上能够稳定表达,且两个世代中稳定遗传。转基因株系灌浆期叶片中的精氨酸酶活力显著高于对照,萌发种子和苗期根中极显著高于对照,种子萌发时酶活力最高。转基因株系百粒重、穗重和小区产量显著高于对照,穗长极显著高于对照,其他各产量相关农艺性状差异不显著。     

白桦花发育基因BpMADS3对玉米的遗传转化及功能验证

MADS-box基因编码多种具有重要生物学功能的转录调节因子,能够激活或抑制其他基因的转录,在调节植物根、叶、花和果实的发育尤其在开花植物花的发育过程中起到重要的调控作用。将东北白桦树中克隆得到的BpMADS3基因导入玉米中,验证其在玉米中的功能。结果表明,利用In-Fushion技术成功构建了BpMADS3基因的单子叶植物表达载体pTF101.1-T-nos-Ubi-BpMADS3,采用花粉管通道法将该基因导入玉米自交系合344中,获得5个T2代PCR和RT-PCR阳性株系,转基因株系H1-25和H1-76的散粉期和抽丝期均比对照提前,穗重、穗长、穗粗和百粒重等产量相关性状显著或极显著高于对照。研究结果初步证明,BpMADS3基因的导入对玉米花期提前和产量增加有一定的功效。     

转异苞滨藜BADH基因玉米高世代株系苗期外源基因表达及耐盐性功能分析

以转来自耐盐植物异苞滨藜的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)玉米T8代株系BZ-136及受体对照自交系郑58(耐盐)为试材,采用盆栽种植方法,分析转基因植株中外源基因的表达情况,检测耐盐相关生理指标。结果表明,转基因株系BZ-136中的BADH酶活性及甜菜碱含量显著高于受体对照,随着盐胁迫时间的延长,其表达量先增加后减少,在胁迫7 d时分别达到了最大值。转基因株系幼苗株高和干重从盐胁迫第3天开始显著高于对照,鲜重和含水量在胁迫第5天和第7天时转基因株系显著高于对照;转基因株系根总体积显著高于对照,直径和根尖数在胁迫第5天时显著高于对照;转基因株系电导率和丙二醛含量均低于对照,分别在胁迫第3天和第7天开始达显著差异,叶绿素含量高于受体对照,从第3天开始二者差异达显著水平。由于外源BADH基因的表达显著提高了基因株系的耐盐性。     

耐盐碱基因eIF1A对玉米遗传转化研究

以来自柽柳的耐盐碱基因eIF1A为研究对象,构建其单子叶植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化极早熟玉米自交系加2和M1的胚性愈伤组织,创制转eIF1A基因玉米新材料,为耐盐碱转基因玉米育种提供技术和材料支持。结果表明,成功构建eIF1A基因的单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-eIF1A,共获得33株除草剂抗性植株,其中,12株目的基因和筛选标记基因PCR呈阳性反应,RT-PCR检测表明,目的基因正常转录表达。     

过量表达拟南芥GPX3基因提高玉米苗期抗旱性研究

通过农杆菌介导法将拟南芥抗旱基因AtGPX3导入玉米自交系郑58中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,在水分胁迫下对T₁代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果表明,共得到56株转化苗,检测获得9个株系的30株T₀代转基因阳性植株,抗性植株阳性率为53.6%。RT-PCR检测表明,T₁代有6个株系为稳定遗传阳性株系,并且AtGPX3基因在转基因玉米中表达量大幅度提高。耐旱性分析表明,非胁迫条件下,非转基因和转基因株系中游离脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量基本无显著差异。在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,比非转基因株系提高了46.2%;MDA含量低于非转基因玉米,比非转基因玉米下降了34%。通过导入AtGPX3基因,可以提高玉米苗期的耐旱性。     

玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因

通过花粉管通道法将脱水素基因BDN1转入玉米自交系合344中,并对转化后代进行PCR和RT-PCR分子检测以及耐盐性功能鉴定,筛选耐盐性较高的转基因玉米新种质.结果表明,实验共获得88株T0代除草剂抗性植株,其中31株PCR检测呈阳性,14株RT-PCR检测呈阳性,对T4代转基因株系苗期进行300 mmol/L NaCl溶液的盐胁迫处理, 2个转基因株系耐盐性比对照提高两个级别.     

玉米精氨酸酶基因过表达载体的构建与遗传转化分析

精氨酸酶是氮素循环中催化精氨酸生成鸟氨酸和尿素的重要酶,可促进氮素的再利用,提高氮素的利用效率。依据Genbank(登陆号:HM369061.1)中水稻精氨酸酶的基因序列,应用RT-PCR方法同源克隆玉米自交系郑58中的精氨酸酶基因ZmArg。序列比对结果表明,克隆的ZmArg基因与GenBank中Zea mays PCO068984 mRNA(B73)序列相似度为99.9%;利用In-fusion技术构建该基因的植物过表达载体pCAMBIA5300-Ubi-ZmArg,导入农杆菌LBA4404用于玉米遗传转化,采用农杆菌侵染玉米芽尖方法转化早熟玉米自交系K10,获得T0代PCR阳性植株27株,其中18株收获种子;对T1代10个PCR阳性株系进行产量比较试验,4个株系百粒重和单株产量明显提高。     

玉米体细胞胚胎功能基因转化研究

22A基因属于TCB1家族,编码GTPase激活因子,与体细胞胚胎的发生密切相关,且只在发育的胚中特异性表达。本研究从玉米体胚中克隆Zm22A基因,并对玉米自交系Y423进行遗传转化。结果表明,以玉米自交系Y423体细胞胚胎为受体,利用Zm22A基因的干扰载体侵染,获得阳性苗。     

转TaSCL14基因小麦的遗传稳定性及农艺性状分析

为了获得农艺性状优良的转TaSCL14基因小麦品系,以普通小麦品种小偃39为受体获得的转TaSCL14基因小麦T1～T3代株(系)为材料,对其中TaSCL14基因的遗传稳定性和主要的农艺特性进行分析。结果表明,转TaSCL14基因小麦的T1和T2代植株的阳性率分别达到55.9%和85.6%,穗粒数、冬前分蘖与对照存在显著差异;T3代4个转基因株系3-4、3-7、3-8和3-11的阳性率达到90%以上,且TaSCL14基因在各株系中的表达水平都高于对照。与野生型相比,转基因小麦T3代部分株系的冬前分蘖、冬后分蘖、有效分蘖和小穗数均较野生型呈显著或极显著提高,但千粒重都较野生型有所降低,其中株系3-4和3-7降低幅度较大,分别达到显著和极显著水平。以上结果说明,TaSCL14基因的过表达能够影响转基因小麦的部分农艺特性,并且在株(系)间有差异。     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

抑制ZmCol3基因表达调控玉米开花期

采用ZmCol3基因RNAi载体构建、农杆菌介导玉米遗传转化、转基因材料开花期表型鉴定等研究方法,评估抑制ZmCol3基因表达对玉米开花期的影响。转基因玉米基因组PCR结果证实,人工合成RNAi片段已成功整合到玉米基因组中。qRT-PCR结果表明,在不同转基因玉米株系中ZmCol3基因表达受到不同程度的抑制。温室转基因玉米开花期相关性状调查结果表明,抑制ZmCol3表达,可以将玉米抽雄、散粉和吐丝时间提前2~3 d。研究结果证实,ZmCol3具有调控开花期的生物学功能,抑制该基因表达进而缩短玉米开花期可以作为行之有效的方法应用到玉米熟期改良研究中。     

耐盐碱转基因玉米的获得及其抗性分析

依据Gen Bank数据库中发表的拟南芥DREB基因序列进行优化,人工合成DREB基因序列,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法将DREB基因转入玉米自交系Hi II中,获得转DREB基因玉米材料,经过分子检测获得4个阳性转化事件。在不同浓度水平的Na Cl溶液(40、80、120 mmol/L)和Na_2CO_3溶液(10、20、30 mmol/L)胁迫下,研究其耐盐碱性。结果表明,DREB基因已经整合到玉米基因组中,转DREB基因玉米的耐盐碱性获得显著提高,80 mmol/L的Na Cl溶液和20 mmol/L Na_2CO_3溶液可以作为转DREB基因玉米的耐盐碱分析条件。     

转植酸酶基因玉米的获得及其后代的初步鉴定

构建了仅含有启动子序列、植酸酶基因和终止子序列的线性基因转化元件(UPN)及其两端分别带有T-DNA边界序列(T-UPN)和一段载体序列(V-UPN)的不同线性转化元件，不含选择性标记基因和载体骨架序列，采用花粉管通道法对选定的玉米自交系进行转化，对728株T1代转化玉米PCR检测。结果表明，UPN、T-UPN、V-UPN 3个转化元件的阳性率分别为0.44%、2.2%和1.8%，平均转化率为1.5%。检测时，以种子在果穗上的不同位置分别播种、检测。结果表明，PCR阳性株都是来源于第5～9圈的种子，这个部位的阳性率达到3.57%，说明花粉管通道法转化玉米的成功率与种子结实的位置有关。植酸酶比活结果说明外源基因在转化玉米植株内实现了蛋白质水平的表达。     

农杆菌介导法将抗草甘膦基因转入玉米自交系

利用农杆菌介导法将抗草甘膦基因(ssu-G₂-aroA)转入优良玉米自交系R18-599和齐319,侵染后的愈伤组织转至潮霉素浓度为10 mg/L的筛选培养基上,继代筛选3轮,每轮3周;得到的抗性愈伤组织在含有潮霉素浓度为3 mg/L的分化培养基上进行分化,R18-599获得30株再生植株,齐319获得18株再生植株。经PCR鉴定后共得到7株转化抗性植株(4株R18-599、3株齐319)。经PCR-Southern及RT-PCR检测结果表明,ssu-G₂-aroA基因已稳定整合到了玉米基因组中,并在RNA水平上得到表达。