适于玉米SSR核心引物的通用PCR扩增反应程序的建立

通过研究退火温度与引物TM值之间的关系,确定玉米核心引物设计时对TM值的特殊要求,通过比较3种PCR扩增程序,确定两步法扩增作为新设计引物的统一的PCR反应程序,为基于玉米SSR核心引物构建多重PCR组合反应进行高通量的基因分型奠定了基础。     

应用PCR-DHPLC技术高通量快速检测转基因玉米

利用多重PCR结合DHPLC技术首次建立转基因玉米高通量快速检测方法。根据公布的转基因玉米外源基因序列设计并合成适合多重PCR的引物序列,以转基因玉米为模板,通过优化多重PCR和DHPLC的反应条件,建立一套同时快速筛选检测玉米中多种转基因成分的7重PCR-DHPLC检测方法。该方法的检测灵敏度为0.195 ng/μL,质粒检测灵敏度为1×103拷贝/μL。     

多重PCR技术在橡胶树转基因分子鉴定中的应用

为了同时检测橡胶树转基因胚状体和叶片中含有的多个目标基因序列,并排除扩增结果的假阴性,利用正交试验首次建立了橡胶树管家基因(HbActin)、目标基因新霉素磷酸转移酶II(NptII)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的多重PCR检测体系。利用2种酶(PCR Mix酶和Taq酶)对18个转基因胚状体和叶片进行单一引物PCR扩增和多重PCR检测。结果表明:多重PCR检测结果与单一PCR结果完全一致,且多重PCR体系带型清晰,无非特异性扩增,更易读取。多重PCR检测系统具有简单、准确并且高效等特点,只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列,因而在转基因分子鉴定上具有非常重要的应用价值与潜力。     

RAPD在玉米温敏型核雄性不育研究中的应用

对适用于玉米的ＲＡＰＤ实验体系进行研究,摸索出适用于玉米的ＲＡＰＤ的反应适宜条件闻稳定的玉米ＲＡＰＤ分析体系,应用这一体系对温敏核雄性不育玉米琼４２－Ｑｍｓ及其可育的近等基因系琼４２进行ＲＡＰＤ分析,在３００多个引物中发现１个引物在两种中扩增带型有差异,经重复试验,初步认为此差异与玉米雄性不育基因连锁。     

利用ISSR标记鉴别玉米品种的初步研究

采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法从10个玉米品种种子胚中提取全基因组DNA,用正交实验法优化ISSR-PCR反应体系,筛选扩增条带清晰的引物,然后用所筛引物对10个玉米品种DNA扩增,分析其扩增带纹差异,找出能够鉴别10个玉米品种的合适引物。研究结果表明:①优化的ISSR-PCR反应参数为:1.5mmol/LMg2 、0.375mmol/LdNTP、0.5μmol/L引物、2.5UTaqDNA聚合酶;②从40条ISSR引物筛选出11条扩增条带清晰、多态性较高的引物,它们共扩增出101条条带;③利用引物UBC808能将10个供试玉米样品区分开。     

分子标记技术在玉米和高粱品种分析中的初步应用

以玉米丹2100和高粱辽杂10号的可见叶片为材料,应用RAPD筛选技术,对玉米、高粱基因进行分子标记.主要结果如下:(1)对玉米丹2100和高粱辽杂10号叶片总DNA提取纯化的方法进行优化,确定提取总DNA的最佳方法.即CTAB法.(2)初步建立了玉米丹2100和高粱辽杂10号RAPD反应体系,并确定了RAPD反应体系中最佳的引物种类及PCR扩增的最佳反应条件,获得了稳定高效的RAPD扩增结果及多态性较好的DNA.(3)应用RAPD技术筛选14个随机引物,共扩增出45条谱带.A2、G4、Y13分别扩增出3条差异谱带分别为OPG-04800、OPA-02450、OPY-13500.     

转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究

根据不同转基因玉米中重组DNA结构,分别对转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603设计转化体特异性引物进行PCR检测。在此基础上分别以玉米内参照基因(ZSSIIb)作对照,对Bt11、Mon810、TC1507和GA21、NK603、Bt176分别作两对四重PCR反应,实现在同一个PCR反应管中同时对3种转基因玉米及内参照基因的特异性检测。     

利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系

转基因大豆305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043作为商品化应用最为广泛的大豆品系,种植面积占世界转基因大豆总种植面积的80%以上。根据大豆内标准基因Lectin和5种转基因大豆品系的边界序列设计特异性引物。通过验证引物的适用性、特异性和灵敏度,优化多重PCR检测体系中不同引物的用量及反应退火温度,建立了能同时扩增大豆内源基因Lectin和5个转基因大豆品系的六重PCR检测体系。结果表明:确定的大豆内源基因和5个转基因大豆品系的引物具有很好的特异性,引物之间无交叉扩增和非特异性扩增,多重PCR方法的检测灵敏度达到0.1%。该方法可作为转基因大豆及其产品成分检测的辅助手段,快速检测转基因大豆及其产品中的相应品系。     

玉米杂交种母本自交系的SSR快速鉴定技术

实验以10个我国主要玉米杂交种的正反杂交组合为材料,分别提取杂交组合果皮、种胚以及母本自交系植株叶片的DNA。每一个正反交组合选取10对多态性SSR引物,对正交组合的母本、正交组合果皮、反交组合母本、反交组合果皮和杂交种F1种胚的DNA进行扩增。数据分析显示,97.5%杂交组合果皮的SSR标记带型呈纯合单一带型,与其母本相同;有2.5%杂交组合果皮DNA扩增出双带型,与杂交种胚相同。根据重复分析结果推测,这可能与母本自交系在某些位点处于杂合状态有关。研究结果表明:采用SSR标记分析玉米杂交组合F1果皮DNA,可以快速鉴定出母本自交系的DNA指纹特征。     

多重引物SSR技术鉴定玉米杂交种子纯度的研究

采用热碱法提取玉米种子DNA,并且运用多重引物(3对SSR引物)PCR对其进行SSR扩增,进行种子纯度鉴定。结果表明:①利用热碱法可以实现玉米种子的DNA快速提取,同时降低了检测成本;②利用三重引物PCR技术降低了检测结果的误差,提高了检测结果的准确性。因此,将这两种技术结合起来,将极大地推动SSR技术在玉米种子纯度鉴定中的推广和应用。     

转基因玉米特异性检测阳性标准分子的构建与应用

试验用PCR方法从玉米中扩增内源基因zSSIIb片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,获得中间载体pMD-zSSIIb;根据Bt11和MON810玉米转化体特异性序列,分别设计带酶切位点的引物,扩增出Bt11和MON810转化体特异性产物;用相应的酶对pMD-zSSIIb和两种PCR产物进行酶切,分别将Bt11和MON810产物克隆到pMD-zSSIIb上,获得阳性标准分子pMD-ZB和pMD-ZM,并对其进行特异性测试。结果表明,获得的阳性标准分子可以作为转基因产品检测时的阳性对照。     

小麦和玉米籽粒赤霉菌产毒类型的PCR检测

为了建立一种准确、快速鉴定赤霉菌毒素的方法,根据赤霉菌毒素生物合成调控路径T ri5-T ri6基因保守序列,设计了一对通用引物,用于检测和鉴别产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(N IV)毒素的赤霉菌特异DNA片断。结果表明,产生毒素DON的赤霉菌具有一个300 bp的特异DNA片断,而产生毒素N IV的则为360 bp。PCR检测与HPLC或GC/M S化学分析结果完全一致。利用这一方法分析检测了小麦、玉米籽粒中赤霉菌产毒类型,发现除健康籽粒外,在所有轻微、中度、严重感染赤霉病的小麦或玉米籽粒中,均同时检测到DON及N IV的两种DNA片断,表明这一对通用引物对两种毒素特异DNA片断的扩增效率相同。这些结果说明,该技术是一种经济、快速、可靠的PCR检测技术,可广泛用于赤霉菌及其毒素检测鉴定中。     

利用SSR标记技术检测玉米杂交种纯度

对玉米子粒DNA提取、SSR扩增片段检测方法等进行了研究,并以4个利用常规种子贮藏蛋白质电泳技术难以鉴定纯度的玉米杂交种及相应自交系和9对玉米SSR位点引物为材料,分别筛选出适合这些不同杂交种纯度鉴定的SSR位点引物,建立了一套利用SSR标记进行玉米杂交种纯度鉴定的技术规程.该程序包括从粉碎干种子提取DNA和利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SSR扩增片段,对仪器设备要求较低、简单、快速,易于推广。     

过量表达拟南芥GPX3基因提高玉米苗期抗旱性研究

通过农杆菌介导法将拟南芥抗旱基因AtGPX3导入玉米自交系郑58中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,在水分胁迫下对T₁代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果表明,共得到56株转化苗,检测获得9个株系的30株T₀代转基因阳性植株,抗性植株阳性率为53.6%。RT-PCR检测表明,T₁代有6个株系为稳定遗传阳性株系,并且AtGPX3基因在转基因玉米中表达量大幅度提高。耐旱性分析表明,非胁迫条件下,非转基因和转基因株系中游离脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量基本无显著差异。在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,比非转基因株系提高了46.2%;MDA含量低于非转基因玉米,比非转基因玉米下降了34%。通过导入AtGPX3基因,可以提高玉米苗期的耐旱性。     

玉米种质资源抗旱性评价方法鉴评与抗旱资源筛选

采用3种评价方法对34份玉米种质资源的抗旱性进行评价,在鉴评抗旱性评价方法的同时筛选抗旱玉米种质资源。结果表明,综合评价方法要优于单一指标评价,即数学分析法与耐旱性分级法均优于总抗性评价法。玉米株高、穗位高、穗上叶夹角、穗粒数、单株产量可以作为玉米种质资源抗旱性鉴定的评价指标。筛选出抗旱性极强的自交系陇M0302和冀资H634。     

不同类型青饲青贮玉米的比较研究

对7个分蘖、高油和高蛋白型青贮玉米特性和品质的比较。结果表明:独秆晚熟品种中北410、青试01和农大647适宜作为春季播种的青贮玉米,解决冬春季饲料不足;多蘖型的新育01和新育02适宜作为春夏季青饲玉米种植,供给夏秋季青饲料;独秆中熟的高蛋白玉米中原单32品质优,适宜作为在6月底到7月上中旬播种的青饲或青贮玉米种植;同时根据品种的生理特性研究栽培技术,指导各类型青贮玉米种植,满足不同青饲青贮需要。     

利用RNAi方法构建MS26基因雄性不育植物表达载体及农杆菌介导玉米遗传转化研究

应用RNAi技术创制了花粉彻底败育的玉米雄性不育株系,为玉米杂交制种提供雄性不育的基础材料。构建玉米MS26 RNAi植物表达载体,其中,以玉米综31未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因定向转入到玉米中,以甘露糖为选择剂进行筛选获得能够稳定遗传的转基因植株。通过Taqman探针法进行分子检测,获得18株单拷贝T0代转基因植株,碘-碘化钾染色分析结果显示,12株完全不育。在田间试验中,5个转化事件的所有T1代转基因植株在散粉期都表现雄性不育,且除此之外与野生型玉米对照植株之间没有其他形态不同。实时定量PCR结果显示,MS26 RNAi转基因玉米植株中MS26基因的表达量显著下调,由此可推断,MS26 RNAiT-DNA已经整合到玉米基因组中,并能引起完全的雄性不育。     

利用RAPD技术鉴别玉米自交系

本文利用RAPD技术对我国28个玉米骨干自交系进行了分析,从300个引物中筛选出了40个多态性好的引物,结果发现：仅使用OPI₁₀一个引物扩增的DNA指纹图谱就能区别开15个自交系,增加引物OPB7可以区分开26个自交系,再增加OPC₁₉、OPG₆、OPA₇、OPI₁₁、OPG₁₄中的任何一个引物就可以将28个自交系完全区分开。研究还表明亲缘关系很近、利用同工酶方法无法区分的姊妹系材料如：478、488和3189,以及双105和双741都能够被明显的区分开,证明了利用RAPD技术进行玉米自交系鉴定完全可行而且是非常有效的。