柚(Citrus grandis Osbeck)单染色体LA-PCR-AFLP分子标记体系的建立

通过微分离和微克隆技术,对柚单染色体LA-PCR-AFLP技术体系中反应程序、模板浓度等关键参数进行了优化和引物筛选。结果表明:退火温度较高的程序TD3[退火梯度:72℃→65℃30 s(-0.5℃/cyc)]扩增效果较好;稀释100倍(10 ng/μL)为最适模板量;10个引物对组合扩增多态性较好。对22条单染色体的AFLP多态性分析和dot-blot杂交验证,表明较好地构建了柚单染色体LA-PCR-AFLP体系。这为柚单染色体的识别和文库构建提供了试验基础。     

用染色体组原位杂交鉴定小麦异源染色体及其片段

用染色体组原位杂交技术对含有I■y■ws ■ltiolis Tzvelev、Thi■pyr■essar(?)icum Love染色体的普通小麦品系染色体切片进行了外源染色质鉴定,并对含有Hordeum chilense Rvem和Shll.、H.vulgare L.与Se■le oereuleL.异源种质染色体群进行了分析。以导入外源染色质的全套染色体组DNA为探针,与来自小麦的过量未标记的块植DNA进行DNA原位杂交。其方法是将外源染色质标记成黄绿色,而小麦染色体则表现为DNA复杂的桔红色荧光。细胞核选自幼苗根尖和药壁组织.鉴定外源染色体和染色体臂的染色体组探测方法.可以在细胞核分裂周期的所有时期进行计数,在前期和间期,二体系的大多数细胞核中,可以看到两个标记区,而单体系仅有一个标记区。在中期,可以直接看到异源染色体或其片段的形态,从而鉴定出异源染色质与小麦染色体的关系。     

黑麦染色体的ASG法G—带分析

用改良 ASG法在黑麦 ( Secale cereale)有丝分裂早中期、中期对染色体进行了 G-带分析 ,并作了G-带带型和变动性分析。结果表明 ,无论是早中期还是中期 ,黑麦染色体都显示了清晰的 G-带 ,而且带纹数目多、细窄而大小较相近 ,分布较密集而均匀 ;同源染色体带纹的数目、分布位置基本一致 ,可较为准确地配对。随着分裂时期的推进 ,G-带带数减少 ,从早中期至中期单倍染色体组 G-带带数减少了 2 9.0 %,单倍染色体组的长度缩短了 2 5.0 %,带纹减少幅度与染色体长度缩短幅度相近。对黑麦 G-带的特征与变动性、G-显带技术及其应用等问题进行了讨论     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

应用单引物PCR获得以Bar基因为锚定基因的转基因水稻侧翼序列

 确定外源基因在水稻基因组上的插入位置,是转基因水稻研究的重要内容之一。为了建立一种简单、快速、准确的获取外源基因在水稻基因组上插入位置侧翼序列的方法,结合前人TAIL PCR引物设计的原则和经验,以转入水稻基因组中的Bar基因为锚定基因,设计了既能作为锚定引物又能作为随机引物使用的一系列单引物,应用这些单引物通过单引物PCR成功获得了外源基因在水稻基因组插入位点的侧翼序列。这种方法与目前较为常用的TAIL PCR相比,简化了70%左右的试验步骤,节省了60%以上的试验时间,是一种简便、快捷的获得未知侧翼序列的方法。     

甜菜无融合生殖系AFLP指纹图谱试验体系的建立

通过利用单酶切和单接头连接体系,在T4连接酶作用下进行连接,以连接产物为模板,在选择引物和ExTaq聚合酶作用下进行PCR特异扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶检测分析。通过对甜菜叶片基因组DNA的分析,确立了适合于甜菜无融合生殖系的最适宜的AFLP试验体系。该方法操作简单、费用低,有利于该项技术的推广和应用。     

基因枪转化的bar基因表达盒在水稻中的重组结构

 应用Southern杂交和引物组合PCR技术研究了基因枪转化的bar基因表达盒（包括启动子、编码区和终止子）在水稻（Oryza sativa L.）中的重组结构。bar基因表达盒的多个拷贝通过重组连接形成1～3个转基因串联子,彼此邻近整合在受体基因组内一个较大的染色体区域，不同转基因串联子之间由水稻基因组DNA间隔，形成转基因簇。bar基因表达盒形成转基因串联子时,存在头接头、头接尾、尾接尾3种连接方式，通常伴随着bar基因片段的截短。     

‘建阳桔柚’果皮黄酮类化合物的提取工艺及其稳定性研究

研究超声法提取‘建阳桔柚’果皮黄酮类化合物的提取工艺,通过单因素、L9(34)正交试验,探讨乙醇浓度、料液比、超声时间、浸提温度对‘建阳桔柚’果皮黄酮得率的影响。结果表明,‘建阳桔柚’果皮黄酮类化合物的最佳提取工艺为:乙醇浓度为70%、料液比为1∶30、浸提温度为40℃、超声时间为25 min,黄酮类化合物提取率为5.96 mg/g;‘建阳桔柚’果皮黄酮类化合物提取物在50~70℃、pH4~7下比较稳定,光照和氧气都会降低其稳定性,金属离子Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)对‘建阳桔柚’果皮黄酮类化合物稳定性影响不大,而Al~(3+)、Fe~(2+)对其影响较大。     

诱导小麦部分同源染色体配对研究进展

小麦染色体配对受一个复杂而精密的基因系统控制,其中Ｐｈ 基因的存在强烈抑制了部分同源染色体的配对 。控制这些基因的表达,将增加部分同源染色体的配对频率,从而发生交换,对于外源基因的转移具有重要意义。本文对小麦染色体配对机制、诱导部分同源染色体配对的手段、外源Ｐｈ 抑制基因的应用等研究进行了综述和讨论,以便利用这些材料在转移外源基因中发挥作用     

外源总DNA直接导入植物后的整合与分子验证

通过对已有的几例外源总ＤＮＡ直接导入植物后的变异研究分析，提出外源ＤＮＡ导入植物后，在种细胞中先与蛋白结合形成“小染色体”，同源结构“单元”经“拟联会复合体”与受体基因组发生重组，非同源性外源ＤＮＡ可能以“Ｂ染色体”方式存在的假说。在此基础上，进一步提出分子育种可能从对总ＤＮＡ的操作发展到对重组结构“单元”的操作与对这种结构单元的直接验证。