一种同时适用于水稻种子叶片的简单快速DNA提取方法

本文报道了一种同时适用于水稻种子和叶片的简单快速DNA提取方法。该方法通过简单的碾磨、加热、离心等步骤便能制备适合PCR的DNA模板。用该方法单人每小时可以提取48个样品的DNA模板。本研究用该方法提IRT132个水稻种子DNA样品及1096个不同生长阶段的水稻叶片DNA样品,用13对PCR引物进行扩增,种子DNA样品PCR扩增成功率为91．0％,3个不同时期取材的叶片DNA样品PCR扩增成功率均在97．0％以上。该方法提取的DNA也可以进行高分辨率熔解曲线分析。     

不同方法从大豆不同组织中提取基因组DNA效果的比较

从大豆组织中获得高质量和足够产量的基因组DNA,是进行大豆分子生物学研究的基础.为进行大豆基因组的PCR,RAPD,SSR等分子生物学研究,分别以大豆种子和其叶片为实验材料,采用改良的SDS法和CTAB法对大豆基因组DNA进行了提取.对DNA的提取效果,采用紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳分析及DNA的限制性内切酶图谱分析进行了综合比较.结果表明,在以叶片为材料时,SDS法和CTAB法的大豆基因组DNA的提取效果差别不大,SDS法稍好于CTAB法.在以大豆种子为材料时,SDS法的提取效果明显优于CTAB法,SDS法可从大豆种子中提取到能够充分满足各种分子操作的高质量和数量的大豆基因组DNA.     

一种改良的大豆DNA提取方法

大豆组织中含有较多的蛋白质、糖类、酚类和脂类物质,要从中提取高质量的DNA比较困难。针对这一情况提出一种改良UREA大豆DNA提取方法(m UREA),该方法用异丙醇沉淀DNA,并配制washing buffer洗涤DNA沉淀。并以大豆叶片和种子为材料,将m UREA法与CTAB法和SDS法进行对比。结果表明,以大豆叶片为材料时,m UREA法提取的DNA产率最高,质量最好;以大豆种子为材料时,m UREA法提取的DNA产率略低于SDS法,但纯度最高。综合来看,m UREA法是一种高效的大豆基因组DNA提取法,从大豆种子和叶片中提取的DNA浓度和纯度都较高,能满足后续各种分子生物学的要求。     

用叶片和种子DNA对玉米M5P型与YⅡ-1型雄性不育细胞质进行归群

利用GenBank上公布的玉米T、C、S群不育细胞质线粒体DNA特异基因T-urf13、atp6-C、orf355的片段序列设计引物,以玉米自交系B77、U8112和150为核背景的3组同核异质系(N、T、C、S、M5P型和YⅡ-1型)叶片总DNA和种子总DNA以及线粒体DNA为模板,经PCR扩增对新型雄性不育胞质MP型和YⅡ-1型进行归群研究.结果表明:①M5P型和YⅡ-1型不育胞质的PCR扩增产物与T群、S群有很大差别,与C群不育胞质的PCR扩增结果相同,M5P型和YⅡ-1型不育胞质可归为C群;②设计的胞质鉴定特异引物以从叶片中提取的总DNA和从种子中提取的总DNA为模板扩增,与以线粒体DNA为模板扩增的结果一致,表明只要提取基因组总DNA就可以用于玉米胞质类型的归群;③基于PCR策略用玉米胞质特异引物对胞质进行归群,不受供试材料核背景的影响.     

用于SSR分析的大豆DNA的快速提取

描述了一种可从大豆种子及叶片中快速提取DNA的方法，既节省时间，又可获得供上百次PCR扩增使用的DNA，并通过实验证明该方法获得的DNA可用于大豆SSR分析。     

用叶片和种子DNA对玉米M5P型与YⅡ-1型雄性不育细胞质进行归群

利用GenBank上公布的玉米T、C、S群不育细胞质线粒体DNA特异基因T-urf13、atp6-C、orf355的片段序列设计引物,以玉米自交系B77、U8112和150为核背景的3组同核异质系(N、T、C、S、M_5P型和Y_Ⅱ-1型)叶片总DNA和种子总DNA以及线粒体DNA为模板,经PCR扩增对新型雄性不育胞质M5P型和YⅡ-1型进行归群研究。结果表明：①M_5P型和Y_Ⅱ-1型不育胞质的PCR扩增产物与T群、S群有很大差别,与C群不育胞质的PCR扩增结果相同,M_5P型和Y_Ⅱ-1型不育胞质可归为C群;②设计的胞质鉴定特异引物以从叶片中提取的总DNA和从种子中提取的总DNA为模板扩增,与以线粒体DNA为模板扩增的结果一致,表明只要提取基因组总DNA就可以用于玉米胞质类型的归群;③基于PCR策略用玉米胞质特异引物对胞质进行归群,不受供试材料核背景的影响。     

碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究

广泛采用提取DNA作为PCR模板的方法主要有CTAB和SDS法2种,但步骤烦琐、耗时长。根据Taq酶储存液和PCR反应缓冲液所含K+离子、Cl-离子和Tween-20等成分,以0.05mol/LKOH为强碱裂解物、2%Tween-20为稳定剂配制碱裂解液,以0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)和2mmol/LEDTA为中和液,经加热裂解和中和两步制备PCR模板。以甘蔗叶片为材料,用新鲜配制含KOH和Tween-20的裂解液,将适量叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解,再中和,形成裂解混合物。直接以裂解混合物为模板,甘蔗内源基因为靶基因,在优化KOH裂解浓度、模板体积、加热裂解时间以及添加适量聚合酶稳定剂的情况下,PCR反应稳定,重复性强。以有代表性的单子叶和双子叶植物叶片为材料,经过多种内源基因PCR反应的反复验证,证实了这种方法的广泛适用性。该方法通过两步制备PCR模板,无需DNA提取过程,使用材料少,可以实现活体PCR检测,为遗传分析和分子诊断提供简便、快速和高效的分析方法。     

基因组DNA快速提取及在转基因大豆检测中的应用

基因组DNA的提取是DNA分子水平研究和检测的重要环节。为补充完善现场检测方法,根据硅膜吸附 DNA的特性,结合过滤膜和注射器,开发一种现场快速提取植物基因组DNA的方法。选取大豆、棉花、油菜、玉米、 水稻5种主要作物的叶片和种子为样品提取DNA,利用PCR和普通重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase am⁃ plification, RPA）对快速提取和QIAGNE试剂盒提取的DNA进行内源基因的扩增。结果显示,快速方法不需要离心 机,现场3分钟完成DNA提取;在DNA得率上要高于QIAGEN方法,但在DNA纯度上低于QIAGEN方法。不过两种 方法提取的DNA都能满足PCR和RPA的需要。利用DNA快速提取方法结合普通PCR、荧光RPA和荧光定量PCR 对转基因大豆SHZD32-1进行实际检测,3种方法的检测结果一致,均能准确检出大豆SHZD32-1的转基因成分。     

改良高盐高pH法提取大豆DNA

大豆除了含有大量的脂类和蛋白质外,还含有糖类和酚类物质,为解决难于从大豆中提取高质量DNA和传统提取方法耗时长的问题,本研究以中豆41与天隆一号的幼嫩叶片(V3)和成熟种子作为材料,对高盐低pH法进行改良,提高其裂解液pH值,同时结合冷冻裂解法缩短裂解时间,使用不同pH值醋酸钠纯化DNA,并与经典CTAB法进行比较,评价其提取DNA的效果及其应用范围。结果表明,高盐高pH法对成熟种子的DNA提取效率较高,且蛋白与RNA污染少。CTAB法提取的DNA虽然完整性较高,但是耗时较长,蛋白与RNA污染较多。另外,高盐高pH法提取的DNA PCR扩增条带清晰,与常规CTAB法提取DNA扩增效果一致,但其DNA质量不能满足高通量测序要求。综上,改良的高盐高pH法是一种快速有效的大豆DNA提取方法,可满足常规分子试验的要求。     

一种高效便捷的水稻DNA提取法及其应用

 以水稻叶片、根和种子为材料,采用高通量快速法提取基因组DNA,用稻瘟病Pita基因分子标记进行检测,获得与预期片段大小一致的特异性条带,对165份育种材料的检测结果与稻瘟病接种鉴定一致。操作方法如下：将少量水稻叶片、根或种子放入 200 μL PCR盘中,加入70 μL 缓冲液A (含NaOH和Tween20),在PCR仪中加热到95℃,保持 10 min,再加入70 μL 缓冲液B (Tris HCl和EDTA),该提取液可以直接用于PCR扩增。该方法具有几个优点：1）成本低,仅用4种化学试剂,共140 μL 提取液;2）操作简便,仅需3步,每人每天可以提取上千份样品;3）仪器设备简单,只用常规的PCR仪;4）可直接提取干种子的DNA;5）DNA质量好,能检测出水稻中的抗稻瘟病单基因Pita,并且与稻瘟病接种鉴定结果一致;6）用量少,只需要 5~20 mg 叶片、20 mg 根或半粒籽粒。尤其是检测大量样本的基因型时, 此种方法更显得高效便捷。     

适用于SSR分子标记的玉米单粒种子DNA快速提取新方法

研究了玉米单粒种子DNA的提取新方法,利用该方法提取DNA,液氮、研磨、离心、沉淀、SDS、CTAB及氯仿都不用,一个工作人员提取100粒种子(1个检测样品)DNA只需30min左右,一天可以提取1600粒种子(16个检测样品)的DNA,并且提取的DNA分子量大,不降解,完全可以满足利用SSR分子标记进行DNA指纹分析的需要,为DNA指纹技术在玉米种子纯度及真伪快速鉴定中的广泛应用解决了关键性技术难题。     

大豆DNA扩增片段长度多态性(AFLP)研究

本文研究ＡＦＬＰ技术在大豆上的应用,在改进大豆种子ＤＮＡ提取方法的基础上,比较同位素与银染检测方法的效果,筛选适宜大于大豆ＡＦＬＰ分析的酶切和引物组合,从而建立了适用于大豆指纹图谱快速鉴定的ＡＦＬＰ操作程序,并对我国野生大豆和栽培大豆代表性材料进行了ＡＦＬＰ分析。     

大豆豆腐产量微样品分析及其应用研究

选用９个百粒重不同的大豆品种和１个杂交组合为材料,分析了不同微样 和量相对于常规小样品分析的精确性,探讨了单粒微样品豆腐产量分析的适用性。结果表明,微样品用量大于或等于２粒时可用于估计品种的干豆腐产量;单粒分析说法与常规小样品分析存在系统偏差,但适当增加重复次数仍具有相对比较价值,并可用于豆腐产量的遗传分析,应用微样品１／１０浆液分析对干豆腐产量进行估计时,样品用量宜在６粒以上,微样品部分豆粉分析     

大豆种子萌发中蛋白质组成的双向电泳分析

采用双向电泳技术分析了大豆种子萌发时期蛋白质的差异表达.研究发现,在考染胶上,通过PDQuest分析,在成熟干种子和萌发种子的2-DE图谱上分别获得341和376个蛋白斑点,两个时期的2-DE图谱非常相近,说明绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未开始降解.有21个蛋白点在萌发的大豆种子中表达量上调,9个表达量下调.对这些蛋白的进一步鉴定将有助于深入理解大豆种子萌发过程的生理及分子机制.     

大豆鼓粒及其与农业气象条件的关系

本文于公主岭以大豆吉林3号品种为材料对大豆鼓粒及其与农业气象条件的关系进行了研究。 大豆鼓粒有三个明显时期:鼓粒初期,籽粒形成时期;鼓粒中期,籽粒主要增长时期;鼓粒后期,籽粒脱水成熟时期。从开始鼓粒日期迄止于最高干物重出现之间的日数为大豆鼓粒期长度。 大豆鼓粒时期籽粒鲜重、个重、含水量与体积均有一定的变化规律。干物重的变化与时间呈直线关系;鲜重和含水量的变化均与时间呈抛物线趋势。 气温、降水量、20cm土壤相对湿度等农业气象条件对大豆鼓粒都有直接影响。大豆鼓粒期间旬平均气温低于19.0℃,降水量少于30mm,20cm土壤相对湿度低于20.0％,会妨碍大豆正常鼓粒,大豆鼓粒中期最忌低温和干旱。8月下旬是吉林省中部地区大豆鼓粒的气候生态关键期。在大豆鼓粒中期少雨的年份要及时进行灌溉,才能保证大豆高产稳产。     

阿特拉津对不同种子大小品种大豆的危害

玉米和大豆轮作是我国东北地区应用广泛的种植方式,但玉米田除草剂阿特拉津常引起下茬大豆药害。选用东北地区推广应用的45个不同种子大小的大豆品种（粒重范围81～302 mg/seed）进行温室盆栽试验,探讨大豆地上冠部和地下根系对阿特拉津危害的响应。结果表明,阿特拉津在土壤中有效成分用量为500g/hm2的条件下,大豆地上部干物质生产随种子重量增加而增加,呈显著正相关（P＜0.05）,而根系干物质生产与种子大小未呈显著正相关（P＞0.05）。这说明大粒品种大豆对阿特拉津耐药性强,小粒品种则敏感,因此,种植大粒品种大豆或品种中大粒种子,可使阿特拉津对大豆危害降到最低。 

     

Development and validation of a GC–MS method for soybean organ-specific metabolomics

Field mold (FM) can easily deteriorate the preharvest soybean in the field, and Fusarium moniliforme is demonstrated as the dominant pathogenic fungi. Metabolomics is a powerful tool to reveal the resistance mechanism in response to microbial infection. Therefore, in this research, the Design of Experiment (DOE) model was developed to optimize the extraction solvent combinations for metabolomic study of soybean seed and pod based on gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS). Combined with the number of extracted peaks and the peak area of common substances, the extraction efficiency of different solvent was analyzed by multivariate statistical analysis. The result showed that isopropanol/water/methanol (1:1:1 and 1:1:4, v/v/v) mixture was highly efficient for metabolites extractions of soybean seed and pod, respectively. Additionally, the potential metabolites and pathways concerned in FM resistance were explored by the optimized extraction solvent system based on metabolomics analysis. Amino acid metabolism in soybean seed was disturbed by F. moniliforme and metabolic pathways related to energy conversion in soybean pod strongly responded to fungal infection. This study constructs a GC–MS-based metabonomic method for soybean metabolites; comparative analysis of organ-specific metabolomics for soybean fruit could be further applied in soybean metabolomics researches.