欧洲葡萄VvMYB6正向调控花青素合成

从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个MYB转录因子基因VvMYB6。VvMYB6蛋白定位在细胞核,其N端包含1个保守的R2R3结构域。在葡萄中,VvMYB6主要在在根、花器官及果实发育早期表达。在烟草中异位表达VvMYB6,显著促进花瓣和雄蕊中花青素的积累;代谢组分析发现,相比野生型,转基因植株花中累积高含量的飞燕草色素和矢车菊色素。转基因烟草植株中查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮4–还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP葡萄糖–类黄酮–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)基因表达显著上调。结果表明VvMYB6正向调控花青素合成。     

风信子花瓣花色苷组成分析

以12个风信子(Hyacinthus orientalis L.)品种为研究材料,采用英国皇家园艺学会比色卡进行花色描述,利用特征颜色反应确定色素类型,利用UPLC-PAD结合UPLC-Q-TOF-MS技术分析花色苷种类及含量。结果表明,12个品种花瓣中均不含有色的类胡萝卜素,除‘City of Haarlem’和‘Aiolos’以外,均含花色苷。10个含花色苷的品种中,‘Woodstock’花瓣中花色苷含量最高,‘Jan Bos’、‘上农早粉’、‘上农紫红’次之。在这些品种花瓣中共检测到9种花色苷成分,通过与已有文献比对,推定其成分为:天竺葵素3–O–葡萄糖苷、天竺葵素3–O–葡萄糖苷5–O–丙二酰葡萄糖苷、矢车菊素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–葡萄糖苷、天竺葵素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–葡萄糖苷、天竺葵素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–乙酰葡萄糖苷、矢车菊素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–丙二酰葡萄糖苷、天竺葵素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–丙二酰葡萄糖苷、天竺葵素3–O–阿魏酰葡萄糖苷–5–O–丙二酰葡萄糖苷和天竺葵素3–O–咖啡酰葡萄糖苷–5–O–丙二酰葡萄糖苷。‘上农早粉’、‘上农中粉’、‘Gipsy Queen’、‘Marconi’等品种花瓣中仅含天竺葵素花色苷衍生物,其它6个品种则含天竺葵素和矢车菊素的花色苷衍生物,以天竺葵素为主。‘上农早粉’、‘上农中粉’、‘Gipsy Queen’、‘Jan Bos’、‘Marconi’和‘Lady Derby’花瓣花色苷以天竺葵素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–丙二酰葡萄糖苷为主;‘Anna Lisa’、‘Woodstock’花瓣花色苷以天竺葵素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–乙酰葡萄糖苷为主;‘上农紫红’和‘Sky Line’花瓣花色苷分别以矢车菊素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–丙二酰葡萄糖苷以及天竺葵素3–O–香豆酰葡萄糖苷–5–O–葡萄糖苷为主。     

芸薹属5种紫红色蔬菜花青素苷含量及组分分析

采用高效液相色谱-质谱法对芸薹属中红叶芥菜、紫红色大白菜、红菜薹、紫色白菜和紫结球甘蓝新鲜叶片所含花青素苷含量和组成进行鉴定。结果表明,这些蔬菜中花青素苷主要组分为矢车菊素苷,兼有少量的飞燕草素苷和矮牵牛素苷。红叶芥菜、紫红色大白菜、紫色白菜和红菜薹中均含有矢车菊–3–p–香豆酰–丙二酰–葡萄糖苷–5–葡萄糖苷、矢车菊–3–阿魏酰–丙二酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷和矢车菊–3–芥子酰–阿魏酰–槐糖苷–5–丙二酰–葡萄糖苷,分别达到总量的46.51%、56.04%、46.38%和68.96%。紫结球甘蓝主要花青素苷成分为矢车菊–3–芥子酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷,矢车菊–3–槐糖苷–5–葡萄糖苷和矢车菊–3–p–香豆酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷,分别达到总量的41.87%、20.58%和16.02%。花青素苷含量最高的是红叶芥菜,为719.04 μg · g-1 FW;其次是紫红色大白菜,为604.03 μg · g-1 FW;第三是紫结球甘蓝,为264.96 μg · g-1 FW;最低的是红菜薹和紫色白菜,分别为219.07 和130.02 μg · g-1 FW。紫红色大白菜中检测到2 种特有的矢车菊素苷和1 种矮牵牛素苷。     

‘早酥’梨及其红皮芽变‘红早酥’梨类黄酮组分变化与合成模式研究

【目的】探讨不同发育时期‘早酥’梨及其红皮芽变‘红早酥’梨果皮类黄酮组成与合成模式。【方法】以‘早酥’梨与芽变‘红早酥’梨不同发育时期的果实为材料,通过HPLC-MS2法测定其果实发育过程中类黄酮组分的含量变化,通过实时荧光定量PCR测定相关合成基因表达水平的变化。【结果】‘早酥’梨和‘红早酥’梨果皮类黄酮组分与含量差异较大,差异主要集中在黄酮醇、原花青素和花青苷代谢支路。2个品种果实自然发育过程中的类黄酮积累模式基本一致,以酚酸、原花青素、黄酮醇和花青苷为主的多数类黄酮组分的合成高峰位于果实发育早期,随着果实发育成熟,酚酸类物质含量呈现不断下降趋势,大部分原花青素、花青苷和黄酮醇类物质在果实膨大期后含量维持稳定。‘早酥’梨葡糖糖苷类黄酮、原花青素组分儿茶素和原花青素B2在果实成熟期出现第二个积累高峰。类黄酮合成高峰期,大多数类黄酮合成基因表达水平达到峰值。果实发育后期,下游类黄酮合成基因DFR、ANR、ANS和UFGT表达量相应提高。【结论】‘红早酥’梨果皮比‘早酥’梨果皮含有更多类黄酮物质,特别是类黄酮糖苷衍生物的种类更为丰富,含量也显著升高。‘红早酥’梨和‘早酥’梨果皮中的类黄酮合成高峰均位于果实发育早期。随着果实的发育,‘红早酥’成熟果皮中类黄酮组分含量虽有下降,但仍含有较高水平的原花青素和类黄酮糖苷类衍生物。     

越橘叶片秋季变色期间花青苷和叶绿素的变化特性

以4年生‘北陆’越橘为试材,对秋季叶色变化期间花青苷和叶绿素的含量和组分进行了研究。结果表明,随着叶色变化,花青苷总量升高,越到后期增幅越大,叶绿素总量下降,初期降幅较大;全绿叶片中解析出5种花青苷组分,随叶色变化组分增多,全红叶片中解析出11种组分,分别属于飞燕草素、牵牛花素、锦葵色素和矢车菊素;飞燕草素–3–O–阿拉伯糖苷、牵牛花素–3–O–葡萄糖苷和牵牛花素–3–O–半乳糖苷是主要的花青苷组分,共同主导了花青苷总量的变化趋势;飞燕草素和牵牛花素总量随叶色变化增加,但比值不变;叶绿素a与叶绿素b变化趋势一致,但叶绿素a含量较高,变化幅度较大。综合分析认为,花青苷积累量的增加和叶绿素积累量的减少是叶片变色的关键因素;飞燕草素与牵牛花素是主要的两类花青素,其含量和配比可能决定了叶片的红色;‘北陆’叶色变化过程中主要积累3种花青苷组分:飞燕草素–3–O–阿拉伯糖苷、牵牛花素–3–O–半乳糖苷和牵牛花素–3–O–葡萄糖苷,影响了花青苷总量及主要色素的配比,进一步影响了叶片颜色。     

芥蓝不同器官主要营养成分分析

 选择典型的芥蓝品种为材料,分析不同器官可溶性固形物、还原糖、可溶性蛋白、叶绿素、类胡萝卜素,维生素C和总多酚含量,以及抗氧化能力、芥子油苷组分和含量的差异。结果表明：芥蓝不同器官间营养成分的含量差异显著,总体上花序中的总多酚、维生素C和可溶性固形物含量显著高于其它器官;叶片中的叶绿素、类胡萝卜素、可溶性蛋白和抗氧化能力均显著高于其它器官;根系中的芥子油苷,特别是苯乙基芥子油苷和4–甲基硫丁基芥子油苷的含量均显著高于其它器官。芥蓝不同品种间产品器官花薹的营养价值差异显著,如‘JL-02’的总多酚含量和抗氧化能力明显高于其它品种,‘登峰中迟’的4–甲基硫氧丁基芥子油苷和总芥子油苷含量明显高于其它品种。     

菊花花青素苷合成关键基因表达与花色表型的关系

 以切花菊（Chrysanthemum × morifolium Ramat.）粉色花品种‘日切桃红’（‘DF-3’）和其白色花突变体（‘MD’）的舌状小花为材料,研究花青素苷生物合成途径6个结构基因和3个调节基因表达对花色表型的影响。HPLC分析结果发现,‘DF-3’舌状花中含有2种矢车菊素苷衍生物cyanidin 3-O- （6"-O-monomalonyl-beta-glucopyranoside）和cyanidin 3-O-（3",6"-O-dimalonyl-beta-glucopyranoside）,而‘MD’舌状花中不含花青素苷。半定量RT-PCR分析结果显示,在‘DF-3’中结构基因CHI、F3H、F3′H的表达模式相似,在LⅠ期（花蕾直径 < 0.5 cm）均已有表达,表达量随着花序发育上升,在HⅡ期（外层舌状花直立,未展开）达到高峰,随后逐渐下降;结构基因CHS、DFR和ANS在蕾期表达弱,在HⅡ期表达量达到高峰,随后逐渐下降;且DFR和ANS只在舌状花中表达。调节基因WD40和bHLH均先于结构基因在LⅢ时期（外层1 ~ 2轮舌状花展开）即有强烈表达;MYB在蕾期无表达,在HⅠ期才开始表达,在HⅢ期达到表达高峰。突变体中结构基因和调节基因在各发育阶段的表达量均比野生型下调,其中F3H和ANS表达极弱,DFR始终没有检测到表达信号,调节基因MYB和WD40的表达量下调,bHLH的表达量非常微弱。这些结果表明,菊花舌状花中矢车菊素苷的积累是CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR和ANS等关键结构基因共同表达的结果,突变体中调节基因MYB和bHLH的表达下调可能与其白花形成有密切关系。     

芥蓝颜色和蜡质的遗传规律研究及京紫2号的育成

利用深紫色、无蜡质、白花芥蓝和绿色、有蜡质、黄花芥蓝配制F_1、F_2、BC_1和BC_1′世代,研究芥蓝花色、蜡质和薹色的遗传规律,并创制兼具不同花色、蜡质和薹色的芥蓝新种质;同时,比较2个不同类型芥蓝亲本的主要营养成分含量。结果表明:芥蓝的花色、叶片和菜薹的蜡质以及薹色3个性状均为质量性状,分别由1对等位基因控制;白花对黄花为显性,叶片和菜薹有蜡质对无蜡质为显性,菜薹紫色对绿色为显性。无蜡质、紫色菜薹芥蓝的VC、蛋白质、花青素和胡萝卜素含量极显著高于绿色、有蜡质的普通芥蓝,而可溶性糖、粗纤维含量极显著低于普通绿色芥蓝。以芥蓝细胞质不育系CMS.紫芥蓝为母本,以自交系改良红芥蓝薹为父本杂交选育出芥蓝新品种京紫2号,晚熟,生育期80 d左右,株高31.4 cm,开展度50.2 cm,叶片卵圆形、深绿色、有光泽,叶片和菜薹无蜡质,菜薹深紫色,薹长25.0 cm、粗2.04 cm,单株净薹质量65～115 g,口感脆嫩,可多次采收,产量15～20 t · hm~(-2),适合广州等南方地区秋冬季和菜场基地种植。     

遮荫对‘花手鞠’绣球花色和花青素苷组成的影响

以‘花手鞠’绣球（Hydrangea macrophylla‘Hanatemari’）为试材，研究全光照和50%遮荫对其不同开花时期花色和花青素苷组成的影响。采用英国皇家园艺学会比色卡和测色仪测定花色表型；利用高效液相色谱质谱联用技术（LC–MS）定性和定量分析花青素苷组分，并测定色素生物合成关键酶活性和金属离子含量等生理指标；运用多元线性回归法分析花色和生理指标间的关系。结果表明：与全光照相比，50%遮荫的萼片红度值（a*）更低，黄度值（b*）更高，在色彩上更偏粉色；从盛花期到末花期，全光照的花萼红度值（a*）下降88.90%；而50%遮荫仅下降65.67%，有效减缓了花萼的褪色速率。花萼中共检测到矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、锦葵素和矮牵牛素等5种花青素苷元形成的11种花青素苷；主要组分为飞燕草–3–O–葡萄糖苷，占总花青素苷组分的92.12%，是‘花手鞠’花萼主要的呈色物质。50%遮荫有利于花青素苷的累积，其总花青素苷含量（1 286.96μg·g-1FW）较全光照（944.10μg·g-1FW）显著增加了36.32%；初开期苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和查尔酮异构酶（CHI）活...     

‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析

以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’为材料,利用同源克隆法获得1个NAC转录因子,命名为VvDRL1（GenBank：XP-002281816）。该基因全长840 bp,编码280个氨基酸,与‘黑比诺’葡萄中该基因的同源性为100%,但是基因组DNA序列中存在6处单核苷酸突变。瞬时转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,VvDRL1基因主要在细胞核内表达,属于核蛋白;通过农杆菌介导的叶盘法获得稳定整合的转基因烟草,T2代转基因植株生长迟缓,株高、叶面积和叶片细胞面积约为野生型烟草的60%、34%和31%,转基因植株叶片出现向内卷曲现象,利用石蜡切片进行显微结构观察,转基因植株主叶脉上表皮下缺失2 ~ 3层厚壁细胞,且海绵组织内的空隙明显多于野生型植株。研究结果表明,VvDRL1在调控植株的形态发育方面起着重要作用。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

紫心大白菜花青素积累特性及相关基因表达分析

 利用徒手切片法、pH差计法及实时荧光定量RT-PCR技术,观察和测定紫心大白菜与同源非紫心大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour）Olsson]花青素在叶片中的分布和总含量变化,比较叶片中花青素合成途径关键酶基因及其转录调控因子的表达特点。结果表明,紫心大白菜花青素不均匀分布于叶片中,尤以叶表皮细胞及临近表皮的叶肉细胞内最为丰富,并且内层球叶含量高于外层球叶。紫心大白菜心叶中花青素含量最高为0.79 mg · g^-1 FW,对照09S17混合样的叶片中花青素总含量为0.01 mg · g^-1 FW。荧光定量PCR分析表明,花青素生物合成途径上游关键酶基因CHS、CHI、F3H、F3′H及下游修饰基因UFGT、转运酶基因GST与转录因子MYB0在紫色大白菜心叶中上调表达,下游关键酶基因DFR、ANS、LDOX与转录因子MYB2、MYB4、MYB12和MYB111的表达在整个紫心大白菜中大幅上调,推测这可能是紫心大白菜花青素积累的重要原因,其中MYB2和MYB4可能起主要作用。     

基因枪法和农杆菌介导的Bt抗虫基因转化芥蓝

以芥蓝品种小香菇为试材,分别采用基因枪法和农杆菌介导转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝中,并对两种转化方法进行了优化和比较。结果表明:基因枪法在轰击距离为6cm、轰击次数为1次时转化效率最高,为0.43%;农杆菌介导转化法以带子叶下胚轴为外植体、预培养2d、侵染10min、共培养2d、抑菌培养5d后转入筛选培养基为最佳参数,转化效率为0.37%。经PCR和PCR-Southern鉴定,基因枪法和农杆菌介导转化法均成功将目的基因导入芥蓝基因组中。经抗虫性表型鉴定,T_0代转基因芥蓝植株对甘蓝夜蛾幼虫的抗性高于非转基因植株。     

MrMYB1-MrbHLH1:一个有潜力的园艺植物转基因可视化报告基因

将杨梅果实中参与花色苷生物合成的转录因子编码基因MrMYB1和MrbHLH1同时搭载到双元表达载体的多克隆位点内,重组成双价表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法将其分别转入烟草、番茄和森林草莓,成功转化MrMYB1-MrbHLH1的烟草、番茄和森林草莓不定芽因大量积累花色苷而呈红色,与野生型或假阳性不定芽相比,表型差异明显;转化35S::MrMYB1-MrbHLH1的烟草和番茄植株中可显著积累花色苷呈红色,且该性状可稳定遗传。MrMYB1-MrbHLH1在3种园艺植物具有调控花色苷积累而使阳性转化植物部分组织器官呈现红色的功能,是1个有潜力的遗传转化可视化报告基因。     

不同菠萝品种的叶色比较分析

为了利用色素比较评价不同菠萝品种的农艺性状,选取定植在江门地区的4个菠萝品种叶片为试验材料。结果表明,‘金菠萝’的SPAD值和类胡萝卜素最高,显著高于其他3个品种。‘巴厘’的花青苷含量显著高于其他3个品种,‘卡因’的花青苷含量显著高于‘黄金菠萝’。对于绿色叶片而言,高叶绿素含量品种的叶色深绿,低含量的叶色黄绿;对于彩色叶片植株而言,花青苷含量起主导作用。4个品种在色素含量方面有较大差异,色素可以作为进行菠萝品种评价和鉴别的重要指标。     

高温条件下芥蓝菜薹色泽的形成

通过对高温条件下3个芥蓝品种菜薹色素及其相关因素研究,结果表明:芥蓝菜薹的叶绿素、花青苷和类黄酮含量尖叶夏芥蓝均为最高,荷塘芥蓝次之,中花芥蓝最低。尖叶夏的有机酸含量最高,中花次之,荷塘最低。花青苷含量较高的品种,其苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性也比较高。芥蓝菜薹表皮色泽是叶绿素、类黄酮和花青苷等色素的综合表现,并受表皮酸碱性的影响。     

芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定

二氢黄酮醇4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是花青素生物合成晚期阶段的关键酶,属于NAD/NADP依赖型还原酶家族,催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用UV-A处理‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根24 h后提取总RNA,通过RT-PCR方法分别克隆了‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因。BrDFR1和BrDFR2的开放读码框分别为1 158 bp和999 bp,分别编码385和332个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrDFR1和BrDFR2与大白菜DFR具有高度同源性,从第8到第302位氨基酸的肽段具有FR_SDR_e结构域。BrDFR1和BrDFR2基因组全长序列均含有5个位置与序列完全相同的内含子。Southern杂交结果显示,‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因均为单一拷贝。UV-A可以诱导BrDFR1基因表达,对BrDFR2基因表达的诱导效果不明显。BrDFR1和BrDFR2基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分子量约为42.8 kD的BrDFR1蛋白和37.5 kD的BrDFR2蛋白。过量表达BrDFR1和BrDFR2基因的烟草花色加深。芜菁DFR基因的RNAi载体遗传转化烟草后,转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

黄瓜Rubisco 活化酶基因CsRCA 表达载体构建与遗传转化

 核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是光合碳循环中的关键酶,为了探明其在植物体内的活化机制,用农杆菌介导法将Rubisco活化酶（RCA）基因CsRCA导入黄瓜,分别用PCR、real-time PCR和Western杂交法进行分子检测,分析转基因植株的表达量。酶切鉴定结果显示,CsRCA正向插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,成功构建CsRCA的正义表达载体。将pCAMBIA1301-CsRCA导入黄瓜自交系‘08-1’,获得7株转基因植株,拷贝数均为2（非转基因植株的拷贝数为1）,转化率约为3.5%。表达分析结果表明,7株T0代转基因植株叶片的CsRCA mRNA表达量为野生型（WT）的1 ~ 1.98倍,在蛋白水平的表达信号显著强于WT。T1代转基因植株的叶片叶绿素和类胡萝卜素含量、光合速率（P_n）及可溶性糖和淀粉含量均显著高于WT。研究结果表明,利用农杆菌介导法获得了稳定遗传的黄瓜CsRCA转基因植株,CsRCA过量表达能显著提高黄瓜叶片的P_n,增加干物质积累。