马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列的cDNA-AFLP鉴定

 利用具有6个无毒基因不同表现型且处于萌发中的静孢子时期的马铃薯晚疫病菌构建4个混合池, 通过cDNA2AFLP分析, 共获得85个与无毒基因相关的差异表达片段, 其中与无毒基因Avr1、Avr2、Avr3-Avr10-Avr11、Avr4 相关的差异表达片段分别为20, 28, 16和21个。将这些差异表达片段对20个晚疫病病菌个体进行无毒基因差异表达验证, 得到1 个无毒基因连锁群Avr3-Avr10-Avr11 的候选片段, 即A11T13Avr3-10-11S157; 无毒基因Avr4的候选片段2个, 即A24T19Avr4S122和A24T24Avr4S142。Blast分析表明: A11T13Avr3210211S157 与马铃薯晚疫病菌萌发孢子囊( germinating sporangium ) EST ( expressed sequence tag) 库中的序列PG001F10.XT7 同源; A24T19Avr4S122 与晚疫病菌萌发中静孢子( germinating cyst) EST库中的PH051G10.XT7部分序列完全一致, 而A24T24Avr4S142与PH051G10. XT7具有98%的同源性。这些结果将促进通过电子克隆并结合RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术获得全长的无毒基因Avr4。     

马铃薯广谱抗病Rpi-blb1 同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服

 马铃薯晚疫病广谱抗性基因Rpi-blb1（克隆于Solanum bulbocastanum）及其两个同源抗病基因Rpi-sto1（克隆于Solanum stoloniferum）和Rpi-pta1（克隆于Solanum papita）的抗性可能已被高度进化的晚疫病菌株所克服。为证实此观点,将从荷兰田间和墨西哥野外S. bulbocastanum 和S. stoloniferum 病株上采集的晚疫病菌株重新接种于具有共同遗传背景（感病栽培品种Desiree）的Rpi-blb1 及其同源基因转化体和3个野生种植株上,测试Rpi-blb1 及其同源基因的抗性是否已被克服。结果表明,采自墨西哥野外S. stoloniferum的两个菌株Pic99189 和Pic99192 已经克服了Rpi-blb1 及其同源基因的抗性;在野生种植株的测试中,只有S. papita 的抗性明显地被菌株Pic99192 所克服。同时发现在转基因植株离体叶片接种试验中,高抗晚疫病菌的转化体需要在多个转化体间进行选择。从采自中国4 个不同地区晚疫病菌株接种sto1.Desiree 转化体的小规模测试中可推断,Rpi-blb1 及其同源抗性基因在中国仍具有潜在的应用价值。     

马铃薯广谱抗病Rpi-blb1同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服

马铃薯晚疫病广谱抗性基因Rpi-blb1(克隆于Solanum bulbocastanum)及其两个同源抗病基因Rpi-sto1(克隆于Solanum stoloniferum)和Rpi-pta1(克隆于Solanum papita)的抗性可能已被高度进化的晚疫病菌株所克服。为证实此观点,将从荷兰田间和墨西哥野外S.bulbocastanum和S.stoloniferum病株上采集的晚疫病菌株重新接种于具有共同遗传背景(感病栽培品种Desiree)的Rpi-blb1及其同源基因转化体和3个野生种植株上,测试Rpi-blb1及其同源基因的抗性是否已被克服。结果表明,采自墨西哥野外S.stoloniferum的两个菌株Pic99189和Pic99192已经克服了Rpi-blb1及其同源基因的抗性;在野生种植株的测试中,只有S.papita的抗性明显地被菌株Pic99192所克服。同时发现在转基因植株离体叶片接种试验中,高抗晚疫病菌的转化体需要在多个转化体间进行选择。从采自中国4个不同地区晚疫病菌株接种sto1.Desiree转化体的小规模测试中可推断,Rpi-blb1及其同源抗性基因在中国仍具有潜在的应用价值。     

黑龙江省马铃薯晚疫病菌与采集年份和地理来源相关性分析

以2005、2006、2008年采集于黑龙江省哈尔滨市的17份马铃薯晚疫病菌株和2006年采集于黑龙江省8个地点的46份菌株(均为A1交配型)为试验材料,利用21对EST-SSR引物,分别对菌株与采集年份以及菌株与地理来源的相关性进行了聚类分析。结果表明:在相同地点采集的晚疫病菌株与采集年份之间具有一定的相关性;在相同年份采集的晚疫病菌株与地理来源之间也具有一定的相关性。     

抗病诱导剂与杀菌剂混合处理对马铃薯晚疫病的防治效果

采用菌丝生长速率法和孢子囊萌发抑制法测定β- 氨基丁酸（BABA）、苯并噻二唑（BTH）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MJ）4 种抗病诱导剂对马铃薯晚疫病菌菌丝生长和孢子囊萌发的影响,通过盆栽试验筛选出最佳药剂和适宜浓度,将抗病诱导剂与杀菌剂混合进行大田试验。结果表明：离体条件下,4 种抗病诱导剂对马铃薯晚疫病菌的菌丝生长和孢子囊萌发无抑制作用;盆栽试验中,4 种抗病诱导剂处理能够导致马铃薯植株晚疫病病情指数下降和产量增加,且随浓度增加,晚疫病抗性增强,其中BABA 诱导抗病效果最好,适宜浓度为50 μg · mL-1,防效为64.83%。田间试验结果显示,与单独使用化学杀菌剂相比,BABA与杀菌剂混合处理效果更好,晚疫病最终防效高达81.28%,产量为2 911.08 kg ·（ 667 m²）^-1。以上结果说明：BABA 能够较好地诱发马铃薯对晚疫病的抗病性,田间防治推荐将化学杀菌剂与抗病诱导剂BABA 联合使用。     

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10（含抗晚疫病基因R10）、四倍体马铃薯栽培种Katahdin（不含已知抗病基因）及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记：RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

接头连接介导的PCR 扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究

利用接头连接介导的PCR 技术,以前期NBS profiling 试验获得的1 条马铃薯抗晚疫病基因
片段为基础,设计巢式基因特异性引物,扩增获得两侧序列。结果表明：基因组DNA 经DraⅠ酶切后,
在已有536 bp 片段的左侧和右侧均得到序列延伸,右侧扩增得到2 301 bp,左侧扩增得到820 bp,去除
边界序列后,向左延伸789 bp,向右延伸2 273 bp,拼接后共长3 443 bp。采用GENSCAN 进行基因预测,
发现包含内含子在内的晚疫病抗性基因全长2 413 bp,在该预测基因 的UTR 区域设计特异性引物,在马
铃薯抗病和感病的基因型中扩增包含完整基因在内的2 571 bp 序列,发现该特异候选基因与晚疫病抗性相
连锁。     

马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及其抗晚疫病的初步鉴定

为获得抗晚疫病的转基因马铃薯植株,采用根癌农杆菌介导法,以微型薯薯片为外植体,将萝卜抗菌肽基因（AFP）导入马铃薯栽培品种夏波蒂（Shepody）中,通过草甘膦抗性筛选和PCR检测获得了4株转基因试管苗,并经黑暗诱导获得了微型薯。采用离体叶片接种法,对微型薯长出的叶片进行抗晚疫病鉴定,结果表明这4个株系的抗病性均有一定程度的提高。     

马铃薯晚疫病药剂防治试验

采用4种药剂进行马铃薯晚疫病防治试验,结果表明,667 m2用68.75％氟菌·霜霉威75 mL、72％霜脲·锰锌100 g对水均匀喷雾效果最好,药后10 d对马铃薯晚疫病的防效最好,防效分别达80.61％、78.96％,且对马铃薯植株生长安全.     

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10(含抗晚疫病基因R10)、四倍体马铃薯栽培种Katahdin(不含已知抗病基因)及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记： RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

甘肃省马铃薯主产区晚疫病菌生理小种组成与分布

采用国际已知含单显性抗病基因的系列品系,对采集自甘肃省马铃薯不同生态种植区的75个菌株进行生理小种鉴定。共鉴定出45 个生理小种,其中生理小种l.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11 出现的频率最高,占被测菌株总数的22.67％,是甘肃省的优势生理小种;被测菌株中可克服抗性基因R4、R8 和R11 的频率在80% 以上,可克服抗性基因R8 的菌株普遍存在于各采集地。     

番茄对晚疫病的株龄相关抗性及Ph-3的抗性机制

目前已明确番茄抗晚疫病R基因表现明显的株龄相关抗性(Age-related Resistance,ARR),但抗晚疫病QTL的抗性规律尚不明确。以携带抗晚疫病基因Ph-3的栽培种番茄(Solanum lycopersicum)‘CLN2037B’和野生种醋栗番茄(S.pimpinellifolium)‘L3708’以及易感病材料栽培种番茄(S.lycopersicum)‘LA2818’为对照,对含有抗晚疫病QTL的多毛番茄(S.habrochaites)‘LA2099’、‘LA1033’和‘LA1777’是否也存在株龄相关抗性进行了分析。结果表明,携带抗晚疫病QTL的3个材料的6叶期和9叶期植株病情级数均比3叶期明显降低,表明QTL抗性与株龄相关。利用乙烯、水杨酸和茉莉酸素合成或缺失的突变体和病毒诱导基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)技术,初步明确了乙烯和水杨酸参与6叶期Ph-3基因介导的对晚疫病的抗性,而茉莉酸不参与。     

番茄抗晚疫病材料的鉴定及初步转育

 对引入的LA1033、LA2099、LA1777等3份多毛番茄人工接种晚疫病, 证明其均高抗我国番茄晚疫病生理小种T10203, 其中LA2099和LA1777还高抗致病力极强的小种T1020304。直播杂交转育F₁种子可出苗, 但出苗率极低, 且不同母本遗传背景和多毛番茄材料组合间差异明显。与直播相比, 普通MS培养基培养成熟胚可更快速、有效地获得F₁ 杂交种植株。人工辅助授粉F₁ 自交, 田间坐果数也存在明显不同。     

不同抗性番茄品系接种晚疫病菌后超微结构的变化

对不同抗性的番茄品系(自交系5号、CLN2037E及杂交一代) 人工接种晚疫病菌后, 观察叶片超微结构变化。结果表明: (1) 接菌前, 自交系5号的线粒体比CLN2037E和F₁多。(2) 接菌42 h,3个品系都出现质壁分离; 自交系5号和F₁的线粒体增加, 同时出现过氧化物酶体; 自交系5号叶绿体被破坏。(3) 接菌54 h, CLN2037E线粒体增加, 出现过氧化物酶体; F₁有部分叶绿体破坏。(4) 接菌72 h,3个品系都出现细胞壁折叠, 自交系5号的叶绿体只存在零散的基质、基粒片层, 少数线粒体膜破坏和空泡化; F₁的多数叶绿体还存在基本形状; CLN2037E只有少数的叶绿体膜破坏。结论: 接种病菌后, 抗性品系(CLN2037E) 比感病品系(自交系5号) 叶绿体被破坏程度轻, 线粒体增加和过氧化物酶体出现时间晚, 细胞壁折叠很明显。     

黑龙江省马铃薯晚疫病菌的交配型和multi-locus基因型分析

2015~2017年在黑龙江省哈尔滨市、绥化市和齐齐哈尔市各马铃薯主产区共采集分离了126株马铃薯晚疫病菌菌株,测定交配型、mtDNA单倍型、SSR基因型并进行multi-locus基因型分析。结果显示,126株菌株中发现了A1、A2、自育型3种交配型,分别占分离菌株总数的88.1%、6.3%和5.6%。126株菌株中共鉴定出Ⅰa和Ⅱa两种mt DNA单倍型,分别占分离菌株总数的17.5%和82.5%。126株菌株中共鉴定出7种SSR基因型,分别为F-01、F-02、F-03、F-05、F-06、D-03和G-02,其中F-01基因型(77.8%)为优势基因型。根据马铃薯晚疫病菌的mt DNA单倍型和SSR基因型,共划分了9种multi-locus基因型,其中multi-locus基因型A(65.1%)是黑龙江省发现的优势基因型。2015~2017年黑龙江省马铃薯晚疫病菌群体结构逐年复杂,绥化市马铃薯晚疫病菌群体结构最为复杂。     

马铃薯晚疫病水平抗性的QTL标记评价

 以11个马铃薯晚疫病水平抗性杂交组合后代的636个基因型为材料, 对4个与晚疫病( Phytophthora infestans) 水平抗性相关位于不同染色体的QTL位点标记GP179、GP76、prp1和GP125进行了评价。结果显示: 4个QTL位点标记共有6个特征带, 在不同遗传背景的组合中带型分布存在差异; 田间抗病性与4个标记的总带数呈极显著直线相关; 主要成分分析表明, p rp1570位点标记解释了供试材料35%的抗性表型变异, 为主效QTL。结合抗性表型分析, 组合群体的抗性与QTL位点数有关, 而个体的抗病水平与主效QTL有关。     

瓜类蔬菜幼苗对辣椒疫霉菌的抗病性鉴定

以10种瓜类蔬菜幼苗为材料,在其2片真叶展平时,分别以孢子浓度为2×103、2×104、2×105个.mL-1的辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液进行了人工灌根接种和苗期抗病性鉴定。结果表明,不同瓜类蔬菜品种幼苗对辣椒疫霉菌的抗病性表现完全不同,其中早熟1号肉丝瓜和新秀丝瓜幼苗未感染辣椒疫霉菌;其余9种瓜类蔬菜幼苗随着接种辣椒疫霉菌游动孢子浓度的提高而抗病性降低,在接种辣椒疫霉菌游动孢子浓度为2×104个.mL-1时,蜜本南瓜和新广优节瓜幼苗抗病性较强,早优苦瓜和碧峰黄瓜中度抗病,特大新红宝西瓜、秀美青筋白瓜、银辉薄皮甜瓜、台优蒲瓜和晶莹1号西葫芦高度感病。     

四川主要辣椒栽培品种对疫病的抗性鉴定及评价

为了全面、准确地评价四川省主栽辣椒品种对疫病的抗性水平,采用室内苗期接种（6～8 片真叶期）、移栽大田后接种（分枝期）和病圃试验（结果期）3 种方法对四川省主栽的56 个辣椒品种进行疫病抗性鉴定。结果表明,5 个辣椒品种采用3 种鉴定方法均对疫病具有抗性,18 个品种均表现为感病,其余品种由于接种时期和栽培环境不同抗性类型发生变化;相关性分析结果表明,室内苗期人工接种能更准确地反映辣椒在田间的真实抗性水平。     

二倍体马铃薯抗旱相关指标筛选

马铃薯是重要的粮菜饲料兼用作物,在我国主要分布在干旱和半干旱地区,干旱严重影响马铃薯的产量。因此,筛选抗旱资源、培育高产抗旱马铃薯品种至关重要。本试验首先对包含121个基因型的二倍体马铃薯群体进行抗旱性评价,依据抗旱系数将所有基因型分为5类。其中高抗旱材料16份,高旱敏感材料14份,进一步从各类别中分别选择1个基因型进行不同水分处理,测定株高、光合作用和叶绿素荧光相关指标及产量等,并计算各指标与产量和抗旱系数的相关性。结果表明:不同水分条件下,随着马铃薯的生长发育和干旱胁迫的加重,各指标与产量及抗旱系数的相关性会发生变化。因此,在筛选高产抗旱材料时,某些指标的测定需要在特定时期进行;盆栽条件下,基质相对含水量为35%～45%时,各基因型抗旱系数与大田的抗旱系数相关性最高,且在该水分处理下与抗旱系数显著相关的指标最多;现蕾期Height和Chl、盛花期P_WUE和Tr与产量显著相关,可以用来初步判断各基因型产量的高低;盛花期基质相对含水量为75%～85%时,P_WUE与抗旱系数显著正相关,可以用来区分所选基因型抗旱性的强弱。