单头柑桔木虱中黄龙病菌快速检测方法建立与应用

将快速裂解制样法和环介导等温扩增技术(LAMP)结合,建立了单头柑桔木虱体内黄龙病菌的快速检测方法。整个检测,从裂解制样(65℃恒温裂解10 min)→LAMP扩增(65℃,30 min)→荧光显色观察(10 000×SYBR greenⅠ染料),在45 min内就可以完成。该方法和实时定量PCR法检测结果一致,其灵敏度高于普通PCR法。该方法操作简便,所需时间短,准确度高,适用于基层检测部门。     

3种提取单头柑桔木虱体内黄龙病菌DNA方法的比较

为找出较优的单头柑桔木虱黄龙病菌核酸提取方法,以饲养于温室内感染柑桔黄龙病的甜橙树上的柑桔木虱为试材,采用3种方法提取单头柑桔木虱的总核酸,对提取的核酸样品进行质量检测,并利用柑桔黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c以及r-rplLAs/f-rplLAs分别进行了常规PCR和qPCR检测。结果表明,3种方法均可以成功提取到单头柑桔木虱总核酸且均能检测到黄龙病菌。3种方法各有优缺点:李菁的方法步骤简单、历时短,提取的核酸浓度较高,但核酸质量较低;氯仿-异戊醇法步骤较多、历时长,提取核酸浓度较低,但核酸质量较高;动物组织直接PCR试剂盒法简便快速,提取的核酸浓度高,核酸质量一般,成本较高。     

一种西瓜叶片DNA快速提取方法

为了解决田间西瓜叶片提取DNA杂质较多及逐个样品提取效率低的问题,建立了基于96孔PCR扩增板,每次提取96个样,并调整提取液改善西瓜叶片DNA质量优化的方法,经超微量分光光度计检测,提取的DNA浓度为287～573 ng·μL~(-1),OD_(260)/OD_(280)在1.96左右,OD_(260)/OD230为1.6～1.9,表明蛋白质、酚类及小分子杂质很少,DNA质量较高;普通引物聚丙烯凝胶电泳检测表明DNA质量稳定、扩增条带清晰。此方法与目前常用的植物基因组DNA提取方法相比具有通量高、速度快、成本低的优点,是适宜于种子企业西瓜分子标记检测相关工作的较好方法。     

新疆阿魏RNA提取的不同方法比较

以新疆阿魏叶片为材料，采用3种不同的方法分别提取其总RNA，用核酸蛋白检测仪、琼脂糖凝胶电泳方法检测其浓度、纯度及完整性，旨在建立提取新疆阿魏总RNA的最适方法，为后续深入研究新疆阿魏生物合成途径及机制奠定基础。结果表明：3种方法均能提取出新疆阿魏叶片总RNA。试剂盒法提取的总RNA质量最好，28S RNA亮度是18S RNA的2倍，条带清晰，操作简单，耗时短；Trizol法提取的RNA质量次于试剂盒法，且过程中无法判断次级代谢产物对RNA提取的影响，Trizol裂解液存在毒性物质；改良CTAB法提取的总RNA质量较差，无法满足下一步试验的要求，操作复杂，耗时较长。因此，试剂盒法为提取新疆阿魏RNA最佳方法。以试剂盒法提取的总RNA为模板进行PCR检测，得到的扩增条带清晰，与目的片段大小一致，进一步证明此方法提取的总RNA质量能够满足后续试验的要求。     

云南普文葡萄柚黄龙病病原分子检测及鉴定

为确定云南林科院普文林场葡萄柚试验园从美国佛罗里达州引种的葡萄柚品种是否感染黄龙病以及其病原类型,采集116个柑桔黄龙病疑似病样进行PCR检测、16SrDNA序列测定及系统进化分析。结果表明,116个样品中共有96个样品感染黄龙病,总感病率达到82.8%;在该试验园分离出的黄龙病菌16SrDNA的序列一致性达到100%,与NCBI中的柑桔黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)、柑桔黄龙病非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和柑桔黄龙病美洲种(Candidatus Liberibacter americanus)序列的相似性分别为100%、97.6%~98.5%和96.0%~96.7%。该试验园葡萄柚上的柑桔黄龙病菌属于亚洲种。     

应用PCR技术快速检测柑桔溃疡病的研究

应用PCR检测柑桔溃疡病，所用引物为5′TTGGTG TCGTCGCTTGTAT 3′和5′CACGGGTGCAAAAAATCT 3′。从病样的叶片、果皮和枝皮抽提溃疡病菌核酸进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳，产生大约220bp的特征条带，与纯培养溃疡病菌的PCR产物一致。试验比较两种核酸抽提方法，微量快速抽提法的灵敏度明显高于高盐抽提法。有症状病样品的不同部位均能检测到溃疡病；病株的无症状叶片、果皮、枝皮有部分检测到病菌。病果园健康植株大多数检测不到病菌，少数植株PCR产物电泳条带较弱。取样量以10～20mg为宜。该PCR技术可用于快速检测柑桔溃疡病。     

柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。     

核桃内果皮RNA提取方法研究

以核桃果壳硬化期的内果皮为试材,针对核桃内果皮木质化程度高且富含多酚多糖的特点,比较CTAB法Ⅰ、CTAB法Ⅱ和试剂盒3种方法提取核桃内果皮RNA的效果。结果表明:3种方法提取的RNA均可见3条带。CTAB法Ⅰ提取的RNA略微拖带,OD_(260)/OD_(280)为1.540,RNA产率为75.9μg/g,RNA完整性差,质量低;CTAB法Ⅱ的RNA图谱较完整,但亮度较弱,OD_(260)/OD_(280)为1.801,产率为86.1μg/g,但RNA提取过程耗时太长;试剂盒法提取的RNAOD_(260)/OD_(280)为2.055,RNA产率96.4μg/g,RNA图谱清晰、稳定、明亮,证明得到的RNA多糖及酚类等去除较彻底,纯度、完整性和产率均较高。因此,应用复杂植物总RNA提取试剂的试剂盒法可获得高质量与高产率的核桃内果皮总RNA,完全满足后续分子生物学研究。     

欧李叶片光合色素提取方法的比较分析

以'宁欧'、蒙原欧李和'农大7号'3个抗旱性不同的欧李叶片为试材,通过比较分析4种提取方式6种提取溶剂对叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素3种光合色素的提取效果,筛选出适合欧李叶片光合色素提取的最佳方案,以期为欧李光合生理、品种选育及抗性生理等方面的研究提供理论参考依据.结果表明:4种提取方法中,研磨法提取效率最高,优选提取试剂C(丙酮∶乙醇=1∶1);干样浸提法效率低,但受品种影响小,优选提取试剂B(95％乙醇);鲜样浸提法提取效率较高,但受品种抗性影响较大.液氮法在保存和研磨过程中色素发生降解,含量较低.     

菊芋基因组DNA提取方法的比较

采用改良CTAB法、改进的高盐SDS法及两种植物基因组DNA提取试剂盒法等４种方法提取菊芋基因组DNA,并进行电泳分析、质量检测及ISSR引物扩增检测。结果表明,改良CTAB法优于其他3种方法,提取的DNA质量较好、纯度较高,能够满足ISSR-PCR扩增要求。     

3种qPCR检测柑桔黄龙病的灵敏度研究

把柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)阳性核酸样品进行梯度稀释后,分别采用HLBp、CQULAP两组TaqMan水解探针法和以rpl基因为目的片段的SYBR Green染料法进行HLB实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测,结果发现,HLBp探针法可以从稀释105倍的阳性叶片核酸样品(病菌拷贝数约为60个)中检测到病原菌,高于CQULAP探针法和SYBR Green染料法。将3种qPCR检测体系用于赣州安远县、寻乌县和赣县送检的60份田间样品检测,结果发现,HLBp探针法的阳性率为86.7%,CQULAP探针的阳性率为60.0%,SYBR Green染料法的阳性率为68.3%。     

一种快速高效提取柑桔样品病原DNA的方法

为从柑桔样品中快速获得高质量的病原DNA,在传统CTAB法基础上，结合热萃取技术，新建立了一种快速提取病原DNA的CTAB简化法。与Solarbio植物基因组DNA提取试剂盒和传统CTAB法相比，该方法所需时间短，1～2 h即可完成整个提取过程，获得的DNA质量高、产量多。采用上述方法提取黄龙病、溃疡病、褪绿矮缩病等3种柑桔病害样品DNA进行PCR检测，CTAB简化法和传统CTAB法的检出结果一致，试剂盒的检出率稍低。新建立的CTAB简化法，适用于柑桔病害大规模DNA检测。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

柑桔黄龙病传病昆虫木虱的研究

前言 柑桔黄龙病是华南地区柑桔生产的严重病害。为了探讨其病原及传病途径,骆学海(1977)、广西柑桔黄龙病研究小组(1977)和赵学源(1979)等进行了木虱传病试验,并提出木虱是柑桔黄龙病的传毒昆虫;柑桔黄龙病的发生与流行,和柑桔木虱分布有关。1978年我们在病叶叶脉的韧皮组织发现病原体后,在广东博罗杨村华侨柑桔场对木虱田间发生规律及生活史进行观察,同时开展柑桔木虱传毒试验,对传毒昆虫唾液腺及传毒后的发病苗进行包埋超薄切片、电子显微镜观察。     

柑桔黄龙病LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中柑桔黄龙病菌的外膜蛋白(OMP)基因序列,设计了一套环介导等温扩增引物,建立了柑桔黄龙病的环介导等温扩增检测方法.该方法灵敏度可达25 pg/μL,与实时荧光PCR方法灵敏度相同.全部反应只需一个可控温的水浴锅在60分钟内即可完成,通过肉眼观察浊度状况即可判定结果.该方法具有简便、快速、灵敏、特异等特点,适用于基层工作站的柑桔黄龙病鉴定工作.     

基于投入产出法的柑桔黄龙病经济损失评估

黄龙病是迄今为止最具毁灭性的柑桔检疫性病虫害,对全球柑桔产业的发展造成了巨大的影响,使果农损失惨重。为此迫切需要量化研究黄龙病对柑桔产业造成的经济损失,从而为有效防控柑桔黄龙病、保护果农收益提供理论依据和决策参考。基于微观调研数据,先测算黄龙病暴发导致赣南三县(信丰县、安远县和寻乌县)的直接经济损失,再采用投入产出法评估其间接经济损失。研究发现,黄龙病暴发造成赣南三县2016年的直接经济损失约为44.92亿元,占当年GDP的15.4%;由于关联效应造成赣南三县的间接经济损失约为42.91亿元,占当年GDP的14.71%;黄龙病暴发对当地食品工业和服务业发展也带来了次生影响。     

小白菜叶绿素含量的测定方法比较

以小白菜为试材,研究了5种提取方法对小白菜叶片叶绿素提取效果的影响,并测定叶绿素在5种不同提取液中的稳定性。结果表明:小白菜叶绿素提取效果最好的是混合液(乙醇∶丙酮=1∶1)浸提法,其次为混合液(乙醇∶丙酮∶水=4.5∶4.5∶1)浸提法和混合液(乙醇∶丙酮=2∶1)浸提法,丙酮研磨法和乙醇浸提法效果较差。     

4种改良CTAB法提取石榴成熟叶片DNA的比较研究

为研究从成熟石榴叶片中提取高质量基因组DNA的方法,根据成熟石榴叶片组织中富含多酚、多糖的特点,以峄城中国石榴种质资源圃20种石榴成熟叶片为材料,分别采用改良CTAB法(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)4种方法提取成熟石榴基因组DNA,通过琼脂糖凝胶、紫外分光光度计分析、ISSR扩增等方法检测所提取DNA的质量。结果表明,改良CTABⅣ法能从各个石榴品种的成熟叶片中提取出基因组DNA,琼脂糖电泳胶孔干净,无拖带,且DNA的纯度和完整性都较好,OD_(260 nm)/OD_(280 nm)的比值均为1.8～2.0,无降解现象,其质量、产量都高于其他改良CTAB法。ISSR-PCR扩增结果表明,此方法提取的基因组总DNA完全适于ISSR分析。其主要的步骤是:在石榴叶片的研磨中添加Vc、PVP等抗氧化物质,加入CTAB提取液后65℃水浴30 min后冷却至室温,离心条件为15℃、10 000 r/min、10 min, DNA粗提液用氯仿抽提3次,可获得高质量DNA。     

四季柚的砧木种子和接穗消毒试验

瓯江以南被划为柑桔黄龙病疫区以来,严重阻碍我县的柑桔生产,部优名果——四季抛(柚)的开发亦受到一定限制。要建立四季柚新基地、开发名果生产,其根本出路在于培育无病苗木,而培育无病苗木的重要环节在于砧木种子和接穗的消毒,根据有关资料介绍,砧木种子用54℃～56℃热水浸种50分钟,可杀灭种子内外附着的黄龙病病原;接穗用湿热水蒸气53℃处理50分钟,或用800单位的链霉素与1000单位的盐酸四环素液分别浸1小时与2小时,可以消除柑桔黄龙病和溃疡病病原。为此,我们对砧木种子和接穗消毒与出苗率和成活率的关系等方面进行摸索,现将材料简报如下。     

芦柑黄龙病田间诊断技术

永春县现有芦柑栽培面积10069公顷,2004年产鲜果30万吨,芦柑出口54069吨.芦柑生产规模居全国各县前茅,柑桔出口量多年全国第一,是著名的"中国芦柑之乡". 柑桔黄龙病是世界性的柑桔毁灭性病害.2000年以前永春县柑桔黄龙病发病率均在1%以下;本世纪以来,黄龙病发病率明显上升,2003年发病率2%,2004年底达5%左右.如不能及时、准确的诊断和有效的控制,势必严重影响永春芦柑产业的生存和持续发展.笔者就近年来在永春芦柑黄龙病分布情况调查、病源检测(采样)实践中的认识,浅谈一点体会.