中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

瓜类蚜传黄化病毒在南疆的检测及系统进化

2019年从南疆7个县/市采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)侵染典型特征的47份甜瓜叶片样品,通过RT-PCR进行CABYV的检测,从县/市各选出1份代表性样本,进行特异性片段的克隆、测序,以及核苷酸多样性、蛋白序列和系统发育分析。结果显示,28份样本呈现CABYV阳性,检出率为59.57%,巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县、洛浦县的检出率分别为80.00%、28.57%、83.33%、60.00%、37.50%、71.42%、66.67%。克隆测序获得了707 bp的核酸序列,核苷酸多样性值在0.012～0.018之间,所有序列均具有2个开放阅读框(ORF)。ORF1编码199个氨基酸的外壳蛋白(CP),各县/市的序列相似性为99.07%。ORF2编码191个氨基酸的运动蛋白(MP),各县/市的序列相似性为98.80%。基于CP和MP序列构建的系统发育树表明,各县/市得到的所有CP和MP均聚在亚洲分支。CABYV在南疆甜瓜主产区普遍发生,且不同区域核苷酸变异很低,这些地区的CABYV与中国及日本分离物的亲缘关系较近,而与欧洲及中国台湾分离物的亲缘关系较远。     

广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多样性分析

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害广东省冬瓜的常见病毒。摸索了冬瓜叶片总RNA最佳提取方法,通过基于ZYMV病毒外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列的RT-PCR扩增,检测采集自广东省9个冬瓜产区的76份病毒侵染样品的病毒田间发病率;将扩增产物克隆测序,利用MegAlign软件构建系统发育进化树分析cp基因遗传变异与系统进化。结果表明,24份样品检测为阳性,田间发病率为31.59%;所有参试病毒分离物cp基因全长840 bp,编码279个氨基酸的多肽;测序的16个分离物cp基因的核苷酸序列与推导蛋白的氨基酸序列相似性分别为98.1%~100%与96.1%~100%;所有广东分离物的推导氨基酸序列基序保守,除GD121-9增加2个人类白细胞抗原外,其他均包含5个人类白细胞抗原及1个N糖基化位点,均包含保守potyv_CP功能域及与病毒蚜传相关的结构域DAG三联盒"Asp-Ala-Gly";系统进化分析表明,ZYMV病毒划分为7个基因型,广东分离物均属于同一基因型Ⅰ,包含3个株系;广东地区的16个分离物分为3组,无明显地域选择性。总体上广东ZYMV-cp比较保守,分子变异较小。明确了广东省冬瓜上ZYMV病毒的侵染情况及外壳蛋白基因的变异特点,为对其致病性和抗病毒基因工程等研究提供依据。     

重庆辣椒上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定

为明确重庆地区辣椒上番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的发生情况及其外壳蛋白基因(cp)序列变异特征,采用斑点免疫杂交法(Dot-ELISA)和反转录PCR(RT-PCR)技术对采自重庆的298份辣椒病毒病样品进行了检测和分子鉴定。Dot-ELISA检测结果表明,有40份辣椒样品检测到TSWV,检出率为13.42%。通过电子显微镜在TSWV检测呈阳性的样品中观察到具包膜的球状病毒粒体。设计扩增TSWV cp的引物,选取6个TSWV阳性样品进行RT-PCR扩增,均扩增到大小约750 bp的目的片段。序列分析表明,重庆辣椒分离物TSWV-CQ(KX611497)与已报道的22个TSWV分离物cp基因的核苷酸相似性为96.1%~99.4%,与已报道的TSWV中国分离物亲缘关系较近,表现出明显的地理相关性。     

内蒙古呼和浩特地区苹果坏死花叶病毒的检测与遗传多样性研究

采用RT-PCR方法对从内蒙古呼和浩特地区采集的29份表现花叶症状的海红果(Malus micromalus Makino)叶片样品进行了苹果坏死花叶病毒(ApNMV)的检测,ApNMV的检出率为100%,说明ApNMV在呼和浩特地区表现花叶症状的海红果上普遍发生。分别克隆并测序了29份海红果样品中ApNMV的全长外壳蛋白(CP)基因,结果表明,29个ApNMV分离物CP基因间核苷酸序列一致性为94.1%～99.8%,与NCBI数据库中其他19个ApNMV分离物全长CP基因核苷酸一致性为86.1%～97.1%。利用ApNMV CP基因的全长序列构建了系统发育树,48个ApNMV分离物共分成5个组,本研究中的29个ApNMV分离物与2个日本分离物LC108995和NC040470聚集在一起,形成组Ⅰ;其余ApNMV分离物分别形成了组Ⅱ～组Ⅴ。     

侵染番茄的黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯S病毒CP基因克隆及序列分析

以山西省晋中地区表现褪绿黄化、卷曲、叶脉变黑症状的番茄植株叶片为试材,采用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(Sequence-independent amplification,SIA)方法,对侵染番茄病样的病毒病原进行检测,以期为山西省番茄病毒病的防治提供参考依据。结果表明:该病样由黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯S病毒(PVS)3种病毒复合侵染,将其分别命名为CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ。为明确CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ的分类地位,进一步克隆到了这3个病毒的CP基因序列并进行相似性比较,发现CMV-SXFQ与CMV各亚组代表株系相似性为74.9%~98.8%,氨基酸序列的相似性为82.5%~99.5%;TMVFQ与TMV代表株系相似性为74.4%~99.8%,氨基酸序列的相似性为83.6%~100.0%;PVS-SXFQ与PVS代表株系相似性为93.2%~99.3%,氨基酸序列的相似性为92.4%~100.0%;系统进化分析表明:CMV-SXFQ分离物与亚组ⅠB的CH、HLJ、XJ2、Am、As株系亲缘关系最近;TMV-FQ分离物与IM、Jimo、SXFQ株系亲缘关系最近;PVSSXFQ分离物与Cm、St株系亲缘关系最近。     

东北冷寒产区苹果褪绿叶斑病毒检测及其分子多样性分析

采用RT-PCR对从东北地区和内蒙古自治区8个采样点采集的165份小苹果枝条样品进行了苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的检测,ACLSV的平均检出率为60.6%,说明ACLSV在中国东北和内蒙古自治区普遍发生。对其中25份样品中ACLSV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因进行了克隆和测序,结果表明25个ACLSV分离物CP基因核苷酸序列一致性为84.0%～99.7%,编码蛋白氨基酸序列一致性为90.7%～99.5%;与其他ACLSV分离物CP基因核苷酸一致性为67.7%～99.7%,氨基酸一致性为71.0%～99.5%。世界范围内已报道的ACLSV分离物分成B6、P205、SHZ和Ta Tao5等4个组,本研究中的25个ACLSV分离物分别属于B6、P205和SHZ组;在25个ACLSV分离物间无重组事件。     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

贵州辣椒叶脉黄化病毒分离物检测及其P0、CP、MP基因进化分析

为明确辣椒叶脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus，PeVYV）在贵州辣椒上的发生分布及其分子变异情况。用RT-PCR法对采自贵州省25个采样地点的548份辣椒疑似病毒病样品进行检测。结果表明：129份为阳性样品，检出率为23.54%。将获得的14个不同采样点PeVYV分离物和已报道的中国和其他国家PeVYV分离物进行序列比对，P0基因核苷酸同源性为90.9% ~ 100.0%，氨基酸相似性为97.7% ~ 100.0%；CP基因核苷酸同源性为93.7% ~ 100.0%，氨基酸相似性为97.9% ~ 100.0%；MP基因核苷酸同源性为94.7% ~ 100.0%，氨基酸相似性均为100.0%。在系统进化树中，有13个采样点PeVYV分离物P0基因聚在一起，与中国分离物（KP326573）的亲缘关系较近，而遵义播州PeVYV分离物与澳大利亚分离物的亲缘关系较近。贵州所有PeVYV分离物CP基因与中国、澳大利亚、美国和西班牙分离物聚为一支，但不同采样点的PeVYV分离物又聚为两个不同的分支。而不同采样点MP基因全部聚在一起，且与其他地区PeVYV分离物的差异不明显。研究结果表明贵州辣椒上不同地区PeVYV分离物具有一定的分子差异，存在遗传分化现象。     

苹果茎痘病毒内蒙古分离物基因组序列和生物学特征研究

利用RT-PCR结合RACE技术获得了苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)内蒙古‘金红’苹果分离物(ASPV-NM)全长基因组序列(登录号:MK239268)。该分离物基因组除去Poly A尾共有9 286个核苷酸,与17个已经报道的ASPV分离物全长基因组序列核酸一致性为70.6%～79.2%;基于全长基因组、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)基因和外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因分别将分离物ASPV-NM划分到组Ⅲ、组Ⅲ和组Ⅰ;在ASPV-NM基因组中检测到1个显著的重组事件;将ASPV-NM摩擦接种到西方烟37B上,可引起显著的褪绿黄化症状,利用透射电子显微镜可以观察到典型的病毒粒子。     

浙江柑橘产区柑橘黄脉病毒的发生、分布与分子特性研究

运用RT-PCR技术对采自浙江12个柑橘产地的181份柑橘样品进行检测,首次从浙江的‘佛手’柑(Citrus bergamia)和‘红美人’橘(C.reticulata)上检测出柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),其检出率分别为68.0%和47.2%。选取4个CYVCV毒株与11个已知CYVCV毒株进行全序列分析,结果显示CYVCV序列保守性较高,所有15个CYVCV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.9%~99.8%和97.9%~99.4%。虽然采自浙江的4个CYVCV毒株在进化树中聚成单独的簇,但CYVCV毒株间的亲缘关系可能不与其采样地的存在相关性。     

新疆哈密瓜病毒的DAS-ELISA检测和分子鉴定

为了明确当前新疆哈密瓜病毒病的主要毒原种类及其遗传分化,为哈密瓜病毒病害的防治提供科学依据,对吐鲁番、鄯善、昌吉等哈密瓜主产区的病毒病调查、采样,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS–ELISA）和RT-PCR技术对侵染哈密瓜的7种主要病毒及瓜类重要检疫性病毒--黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）进行检测和分子鉴定。结果表明：在所检测的121个样品中,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的检出率最高,为70.2%;西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）和小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）次之,分别为62.0%和37.2%,甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus,MNSV）的检出率仅为2.5%,CGMMV、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus,SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus W,PRSV-W）和烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus,TNV）未检测到。CMV、WMV、ZYMV在田间分布广泛,2种及3种病毒的复合侵染发生普遍（60.19%）。对各病毒分离物进行CP基因扩增、序列测定和系统发育分析,确定了CMV新疆哈密瓜分离物归属于CMV亚组ⅠB。ZYMV、WMV和MNSV与已报道的病毒株系CP基因核苷酸序列具有较高的同源性,但存在一定的变异,ZYMV和WMV具有明显的地域分化现象。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。     

中国葡萄卷叶相关病毒7检测及基因变异分析

葡萄卷叶相关病毒7(grapevine leafroll-associated virus 7,GLRaV-7)是与葡萄卷叶病相关的重要病原物之一。为明确中国GLRaV-7分离物的基因序列变异,采用RT-PCR方法对采自中国15个省(市)、自治区的188份葡萄样品进行检测,检出率为24.5%(44/188)。对来源于42个GLRaV-7分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)和15个分离物的热休克蛋白70(heat-shock protein 70,HSP70)基因进行克隆、测序。序列分析结果显示,来源于国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.12%~100.00%和88.94%~100.00%、85.33%~100.00%和88.97%~100.00%。基于CP和HSP70基因序列构建的进化树,分别将GLRaV-7分离物划分为6个和5个明显区分的组群。Gp3、Gp4和Gp5仅由中国分离物组成。本研究中初次分析国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因序列变异,可为进一步开展GLRaV-7分子检测的研发及不同变种的致病性研究提供依据。