GFP标记溶磷草木樨中华根瘤菌CHW10B及其定殖

[目的]为有效利用草木樨中华根瘤菌CHW10B菌株,对绿色荧光蛋白(GFP)标记的菌株在南方红豆杉根际及其根部的定殖进行研究.[方法]采用修改的反复冻融转化方法,将穿梭载体pGFP4412质粒转化进入草木樨中华根瘤菌CHW10B细胞,对该菌株进行GFP标记,筛选荧光表达强烈且稳定遗传的转化子,对转化子的细胞及菌落形态特征进行观察,并采用钼锑抗比色法对其溶磷能力进行测定.在此基础上,以GFP基因标记和抗性标记作为示踪手段,将GFP标记的CHW10B菌株接种到南方红豆杉1年生盆栽实生苗根表面,借助荧光显微镜及稀释涂布技术,对根际土壤中GFP标记菌株进行定期回收检测.[结果]成功获得CHW10B菌株荧光表达强烈且稳定遗传的GFP转化子,该转化子及野生菌株均为革兰氏阴性(G-),短杆菌,但二者在LB固体平板上的菌落形态有一定差别.野生菌株菌落呈圆形、边缘整齐,表面湿润黏稠,为乳白色;而标记菌株CHW10B-GFP2菌落表面为浅棕色,其他一致;标记菌株溶磷能力与野生菌株接近,发酵液上清液中可溶性磷含量分别为639.12和656.57 mg·L-1.GFP标记菌株在南方红豆杉根际的数量变化幅度较大,接种1天根际土壤中CHW10B转化子菌数为6.08×107cfu· g-1,随后细菌数量迅速减少,15天后标记细菌数量开始增多,25～ 40天菌体数量升高并呈平稳趋势.用荧光显微镜对接种40天后南方红豆杉的根部进行观察,发现在根系表面及其内部有大量发绿色荧光的GFP标记细胞存在.[结论]GFP基因标记的CHW10B菌株在南方红豆杉幼苗根际土壤中具有持久性定殖的能力;另外,该标记菌株能在根表面和内部定殖,具有内生性.     

毛竹根际新黑曲霉的解磷特性及促生作用

[目的]探究毛竹根际微生物新黑曲霉(Aspergillus neoniger)JXBR16对土壤难溶性磷酸盐的溶磷作用及对毛竹的促生效果。[方法]采用液体发酵培养法研究该菌株对Ca_3(PO_4)_2、CaHPO_4、FePO_4、AlPO_4和植酸钙等5种难溶性磷酸盐的溶解能力及碳源、氮源、pH、装液量和盐离子等因素对其解磷能力的影响;并采用温室盆栽法评价该菌株对毛竹实生幼苗的促生作用。[结果]表明,新黑曲霉对5种难溶性磷酸盐均具有较好的溶解能力,其中对FePO_4、CaHPO_4的溶解能力最佳,解磷量分别达3 208.31和3 027.09 mg·L~(-1);在碳源为蔗糖或葡萄糖、氮源为硫酸铵、初始pH值3.5、装液量2/5、温度25℃和盐离子浓度为0～1.0 g·L~(-1)条件下新黑曲霉的解磷能力最佳。施用该菌株180 d后毛竹根际土壤有效磷和矿质氮分别提高37%和41%,植株根、茎和叶磷含量分别提高了95%、102%和43%;毛竹地径、苗高和生物量分别比对照显著提高了44%、47%和50%。[结论]新黑曲霉能够有效增强南方红壤区毛竹林土壤磷的供给,促进植株养分吸收利用,并提高毛竹的生长,具有应用于竹林生物菌肥研制和开发的巨大潜力。     

杉木人工林土壤溶磷细菌筛选及培养条件优化

[目的 ]从红壤区杉木人工林土壤中,筛选出具有高效溶磷能力的菌株及优化其培养条件。[方法 ]通过Pikovskava(PVK)无机磷培养基分离、筛选溶磷细菌,通过生理生化试验16SrDNA基因序列分析对溶磷能力强的菌株进行鉴定;采用单因素试验,比较菌株在不同培养时间、培养初始pH、培养温度、接种量、碳源、氮源、磷源条件下的溶磷能力;采用正交试验进行菌株培养条件优化。[结果 ]筛选出13株具有溶磷能力的细菌,其中P5的溶磷能力最强,在PVK培养基中溶解磷含量为196.61 mg·L~(-1)。根据其生理生化特性和16SrDNA基因序列分析,该细菌鉴定为Burkholderia ubonensis。单因素试验表明菌株较耐高温,耐低pH,正交试验结果显示P5溶磷效果最佳培养基组合和培养条件为2.0%(w/v)蔗糖,0.2%(w/v)氯化铵,初始p H为5.5,培养温度为30℃。在最佳条件下培养基有效磷含量为268.69 mg·L~(-1),约为PVK培养基的1.4倍。[结论 ]菌株P5耐高温、低pH,溶磷能力较强,在微生物肥料的开发利用及在环境胁迫土壤中具有应用潜力。     

南方红豆杉细胞悬浮培养体系优化及动力学研究

[目的]南方红豆杉细胞悬浮培养体系优化及动力学模型构建。[方法]以南方红豆杉1年生枝条诱导产生的愈伤组织为材料,在优化愈伤组织接种量、培养基初始pH、植物激素类型及配比的基础上,分析南方红豆杉悬浮细胞生长和紫杉醇积累的动力学关系及主要营养成分的变化。[结果]适合南方红豆杉悬浮培养的培养基为:B5+0.4 mg·L~(-1) 2,4-D+0.3 mg·L~(-1) NAA+1.2 mg·L~(-1) 6-KT+30 g·L~(-1)蔗糖,培养基最佳初始pH为5.8,最佳接种量为0.09 g·mL~(-1)。在1个培养周期内,培养液中的糖、磷元素,铵态氮、硝态氮在细胞培养的第18天基本被消耗完全或保持不变;动力学拟合表明,南方红豆杉细胞悬浮培养生长符合Logistic生长模型,最大比生长速率为0.143 65 d~(-1),底物消耗和紫杉醇合成可用Luedeking-Piret模型描述,悬浮细胞生长与紫杉醇积累属于部分生长偶联型。[结论]南方红豆杉细胞悬浮培养体系优化后,通过模型的回归拟合,获得了反映南方红豆杉细胞培养的动力学参数,试验所构建的发酵动力学模型在一定程度上揭示了南方红豆杉细胞产紫杉醇代谢过程的特征。     

樟子松固沙林土壤可培养固氮细菌的群落结构

为探明樟子松固沙林土壤中可培养固氮细菌的种类及其能力,丰富植物促生细菌菌种库,以传统纯培养方法筛选获得固氮菌株,基于16S rRNA基因,对其进行系统发育分析,并以靛酚蓝-分光光度法和钼锑抗比色法对所得菌株进行产氨和溶磷能力分析。结果表明,分离获得的12株固氮细菌以变形菌门、放线菌门和厚壁菌门3个门,6个科,7个属组成。变形菌门(50.0%)为优势门,Oxalobacteraceae(33.3%)和Microbacteriaceae(33.3%)为优势科,Curtobacterium(33.3%)为优势属。菌株的产氨能力在0.118～1.639 mg·L~(-1)之间,15-17、56-2、15-8和42-4菌株具有较强产氨能力,分别为1.639 mg·L~(-1)、1.470 mg·L~(-1)、1.301 mg·L~(-1)和1.132 mg·L~(-1);有7株固氮细菌具有溶磷能力,36-5和30-3菌株均具有较强溶磷能力,分别为32.24 mg·L~(-1)和37.63 mg·L~(-1)。樟子松固沙林土壤蕴藏有多种固氮细菌,均有产氨能力且多数兼具溶磷能力,可作为植物生长促生细菌的重要来源。     

荧光假单胞菌的溶磷机制及其在杨树菌根际的定殖动态

【目的】探究荧光假单胞菌菌株JW-JS1的溶磷能力及其在杨树根际和菌根际的定殖动态,揭示菌株的溶磷机制并进一步阐明溶磷细菌与外生菌根真菌的互作机制,为杨树专用复合菌剂的开发与应用提供理论依据。【方法】通过液体培养试验分析荧光假单胞菌菌株JW-JS1培养液可溶性磷含量、p H和可滴定酸含量的变化,采用高效液相色谱(HPLC)法测定有机酸种类和含量,利用抗利福平标记法筛选稳定的标记菌株,运用灌根法研究其在杨树根际和菌根际的定殖动态。【结果】1) JW-JS1菌株培养液可溶性磷含量随接种时间延长逐渐增加,培养液pH与可溶性磷含量呈极显著负相关(r=-0.889~(**)),可滴定酸含量与可溶性磷含量呈极显著正相关(r=0.958~(**));2) JW-JS1菌株分泌的总有机酸量(434.39 mg·L~(-1))明显高于CK (25.94 mg·L~(-1))(P0.05),共检测出草酸、酒石酸、柠檬酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸5种有机酸,其中,草酸含量(273.69 mg·L~(-1))明显高于其他种类有机酸,约占总有机酸量的63.01%;3)筛选出含有300μg·mL~(-1)利福平抗性的标记菌株JW-JS1~(Rif),与原始菌株相比,其菌落形态和溶磷能力均未发生明显变化(P0.05);4)标记菌株在杨树根际和菌根际均能长期稳定存活并保持一定的定殖数量,随接种时间延长定殖数量呈下降趋势,定殖动态基本一致,其中,接种50天后定殖数量分别为5.2×10~4和4.5×10~4cfu·g~(-1)。【结论】荧光假单胞菌菌株JW-JS1的溶磷能力与培养液pH、可滴定酸含量和有机酸密切相关,特别是菌株分泌的草酸可能在溶磷过程中发挥重要作用。荧光假单胞菌菌株JW-JS1在杨树根际和菌根际均能长期稳定存活并保持一定的定殖数量。荧光假单胞菌菌株JW-JS1与红绒盖牛肝菌Xc是构建杨树专用功能复合微生物肥料的理想材料。     

黑木相思根瘤菌ACC脱氨酶活性的研究

根瘤菌能够利用1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)脱氨酶催化ACC脱氨基,从而降低植物体内抑制其生长的乙烯含量,促进植物生长。本研究采用茚三酮比色法测定菌株的ACC脱氨酶活性并对其acd S基因进行了系统发育分析。结果表明,扩增174株供试菌株中,151株检测出ACC脱氨酶活性,但酶活性差异较大。121株扩增出acd S基因,菌株的系统发育关系与地理来源具有相关性,中慢生根瘤菌属菌株的acd S基因具有明显的保守性。菌株ACC脱氨酶活性的高低与acd S基因存在与否的相关性有待进一步研究。ACC脱氨酶活性的检测方法将为快速筛选高效根瘤菌菌株提供可靠的理论依据。     

樟子松固沙林土壤可培养溶磷细菌类群及其溶磷和泌氨能力

为深入理解科尔沁沙地樟子松固沙林土壤微生物的促生性能,实验采用传统纯培养方法,基于16S rRNA基因分析,探究固沙林土壤可培养溶磷细菌类群及其溶磷和泌氨能力。结果表明:分离获得的23株可培养溶磷细菌由变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门4个门,11个科,15个属组成。变形菌门(56.52%)、Oxalobacteraceae(30.43%)和Massilia(17.39%)分别为优势门、科和属。其菌株的溶磷能力在7.37～40.58 mg·L~(-1)之间,8-4(Cohnella plantaginis)、30-3(Bacillus aryabhattai)和30-4(Paenibacillus tyrfis)具有较高溶磷能力。有7株能够在无氮的Ashby固体平板上生长,其分泌氨态氮范围为0.118～1.132 mg·L~(-1),其中42-4(Massilia brevitalea)、8-3(Curtobacterium albidum)和42-10(Pseudoduganella danionis)具有较高泌氨能力。由此说明,樟子松固沙林可培养溶磷细菌类群丰富,包含多种溶磷菌和具有泌氨能力的固氮菌,可作为植物生长促生细菌的重要来源。     

一株荧光假单胞菌的溶磷特性及其对杨树的促生效果

从杨树根际筛选出一株荧光假单胞菌JW-JS1菌株,通过液体发酵试验研究其溶磷特性,并利用温室盆栽试验探究其对杨树苗木的促生效果.结果表明:该菌株分别以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源和碳氮比为100∶1时溶磷能力最强,溶磷量分别达到580.72,708.34和608.97 mg·L-1;该菌株分别在温度为30℃,初始pH 7.0,装液量为1/5和NaCl质量浓度为0时溶磷能力最强,溶磷量分别为562.89,594.58,638.62 mg·L-1和527.82 mg·L-1.接种该菌株可显著促进NL-895杨和美洲黑杨苗期的生长和营养元素含量的提高,其中,NL-895杨和美洲黑杨的苗高、地径、鲜质量和干质量分别比CK增长21.96％,5.04％,57.33％,54.36％和51.66％,1.98％,150.18％,168.49％,植株体内P,K,Ca和Mg含量分别比CK增长25.16％,19.75％,17.12％,10.10％和27.55％,125.53％,55.47％,102.94％.     

海南岛热带木本豆科植物根瘤菌的溶磷作用

对23株从海南尖峰岭自然保护区分离出的木本豆科植物根瘤菌及1株热带根瘤菌标准菌株进行溶磷圈定性试验及溶磷定量试验。结果表明:在以无机磷Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养基内,有22株产生明显的溶磷圈;以Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养液中有效磷含量超过平均值219.13mg·L-1的菌株有9株:caf333,caf443,caf336,caf278,caf344,caf444,caf276,caf436和caf341,溶磷能力最弱和最强的菌株分别为caf438和caf341,其培养液中的有效磷含量与对照相比分别增加了0.80和628.57mg·L-1;同一宿主、同一属种的根瘤菌不同菌株之间溶磷能力相差巨大;在以卵磷脂作为唯一磷源的培养基内,24株试验菌株均未出现溶磷圈。     

基于cpDNA rps16序列分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐的遗传关系

【目的】通过测序法分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐在叶绿体rps16序列上的遗传差异,旨在分析三者之间在叶绿体基因上的变化特点和规律,探讨其种间的遗传关系。【方法】选取兰考泡桐、白花泡桐和毛泡桐各15个样本,对其提取的DNA用PCR扩增获得特异片段,并将其纯化与测序。利用软件Clustal X 2.0对所得序列进行排序;运行MEGA 4软件,进行多序列比对,分析其序列特征,并计算出K2P遗传距离。【结果】(1)对获得的rps16序列进行测定分析,得兰考泡桐序列长度分别为932 933 bp;白花泡桐序列长度为932 bp;毛泡桐序列长度分别为916918 bp。对所得rps16序列进行排序后的长度为938 bp,平均GC含量为34.31%。3个种所代表的个体之间共有10个变异位点,占整个序列长度的1.07%。其中有9个变异位点属于碱基插入或缺失类型,占变异位点总数的90%,占整个序列长度的0.96%。有1个变异位点属于碱基替换类型,占整个变异位点总数的10%,占整个序列长度的0.11%。(2)整个rps16片段的序列共有10个变异位点,其中兰考泡桐与白花泡桐在总的变异位点上,具有一致的碱基位点9个,占总变异的90%。而兰考泡桐与毛泡桐相比,没有相同的碱基。【结论】根据三种泡桐的rps16序列的序列特征和变异位点的分析,表明在叶绿体遗传方面,兰考泡桐具有与白花泡桐更多相似的遗传物质,其亲缘关系较近。综上所述,推测兰考泡桐与白花泡桐可能来自同一母系遗传。     

崖柏属植物的核型分析

[目的]为了从细胞学角度探讨崖柏属植物分类与进化问题,[方法]采用根尖压片法对崖柏属5种植物进行核型研究。[结果]表明:崖柏和日本香柏的核型公式为2n=2x=22=18m(2SAT)+4sm,朝鲜崖柏、北美乔柏和北美香柏的核型公式为2n=2x=22=20m(2SAT)+2sm,5种植物的核型均属于1A类型。[结论]该属在柏科中可能处于比较进步的进化地位;通过进化趋势图分析发现,崖柏在该属中分化最晚,而朝鲜崖柏则较原始。     

中间锦鸡儿CiDR1的克隆及干旱胁迫下的表达分析

[目的]研究并了解中间锦鸡儿CiDR1基因功能及其对干旱胁迫的响应,为抗性育种提供候选基因。[方法]通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆CiDR1基因的c DNA全长,利用生物信息学分析软件对其基因结构及功能进行分析和预测。再通过qRT-PCR技术对干旱胁迫后的幼苗中的CiDR1表达模式进行研究。[结果]从中间锦鸡儿中克隆到CiDR1基因的c DNA全长共计4 297 bp,Gen Bank登录号为KP277100。生物信息学分析表明,预测的CiDR1蛋白序列中含有1 243个氨基酸残基,具有抗病基因特征结构域TIR、NB-ARC、LRR等,其等电点为6.35,不稳定指数为42.91,不具备信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质中。定量PCR检测发现,CiDR1基因在幼年期的茎中表达量较低,在成年期的叶片中表达量较高;在干旱胁迫处理后的幼苗中,CiDR1表达水平有明显下降,表明该基因的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关。[结论]中间锦鸡儿在干旱胁迫后其根、茎和叶中CiDR1的表达均明显下降,表明CiDR1的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关,进一步研究发现CiDR1在根、茎、叶中的表达水平可能受发育阶段调控。     

A new norlignan from Taxodium ascendens

A new norlignan, (2R,3R,4S,5S)-2,4-bis(4-hydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-tetrahydropyran (1), together with 9 known compounds were isolated from the branches and leaves of Taxodium ascendens. Their structures were mainly determined on the basis of MS, IR, 1D and 2D NMR spectral evidences. Methanol extract showed inhibitory activity on carbonic anhydrase II with an IC₅₀ value of 4.27 µg/ml, acetone extract and methanol extract inhibited activity of cathepsin B with IC₅₀ values of 2.12 and 3.71 µg/ml, respectively.     

苹果属无融合生殖SERK1基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。[方法]以苹果属平邑甜茶及杂种后代33#为试材,以苹果基因组CDS序列设计引物,通过PCR扩增技术克隆出SERK同源基因的cDNA全长序列,命名为MhSERK1和MhdSERK1(GenBank登录号JQ231273和JQ231272),利用实时定量RTqPCR的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂种后代各组织和器官中的表达模式。[结果]序列分析显示MhSERK1和MhdSERK1编码区序列全长为1 899 bp和1 881 bp,分别编码632和626个氨基酸,其氨基酸序列与其他植物的SERK1同源基因所编码的氨基酸同源性都在80%以上,特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高,高达92.56%,与模式植物拟南芥、烟草等植物的SERK同源基因都具有很高的同源性。实时定量PCR结果表明,在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中SERK1基因的表达量存在差异,其中在子房中的表达量最高,在营养生长的组织中表达量很低,在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。[结论]推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。     

黑木相思与尾叶桉苗期氮素传递的研究

以尾叶桉、黑木相思苗木混栽为研究对象,采用¹⁵N土壤和叶片标记法,在温室盆栽下研究2种植物间在根系完全隔离、部分隔离及无隔离处理下的生长变化及N素传递。结果表明:黑木相思的苗高、地径及生物量等生长指标随着根系隔离的减少而逐渐降低;相反,尾叶桉在根系无隔离处理下,其生长指标都要显著高于根系完全隔离处理,结果表明尾叶桉具有强大的养分吸收能力,混栽条件下会抑制黑木相思的生长。在¹⁵N土壤或叶片标记下,尾叶桉在根系部分隔离、无隔离下的总¹⁵N含量显著高于完全隔离处理(5.0和59.6倍);在土壤标记下,根系无隔离处理的黑木相思总¹⁵N含量显著低于完全隔离、部分隔离处理,而在叶片标记下的完全隔离黑木相思,其总¹⁵N含量显著低于其余2种处理。无论土壤或是叶片标记,黑木相思都能将N素传递至相邻尾叶桉,其N素传递率、传递量随着根系隔离的减少而提高。研究结果表明尾叶桉、黑木相思间能通过土壤渗透等方式传递N素,为桉树、相思的混交模式提供可靠的理论依据。     

Phytochemical and antifungal studies on Terminalia mollis and Terminalia brachystemma

Phytochemical investigation of the stem bark of Terminalia mollis afforded friedelin (1), catechin with epicatechin (2), gallocatechin with epigallocatechin (3) and 3-O-methylellagic acid 4'-O-α-rhamnopyranoside (4). Arjunolic acid with 2α, 3β, 23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid (5), 2α-hydroxyursolic acid (6), gallic acid (7), chebulanin (8) and 2'-O-galloylvitexin (9) were isolated from the leaf. Chebulanin (8), betulinic acid (10), ursolic acid (11), catechin (12), isoorientin (13), orientin (14), isovitexin (15) and punicalagin (16) were isolated from Terminalia brachystemma leaf. The first full unambiguous NMR assignments for (4) and (8), and revised assignments for (9), are reported. Compound (16) showed good activity against three Candida species.     

山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶 DXR基因的克隆和SNP分析

在转录组测序结果分析基础上,以山鸡椒cDNA 为模板,克隆得到山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR 基因cDNA 全长,以山鸡椒基因组DNA 为模板,设计引物、扩增拼接后获得山鸡椒DXR 基因全长,命名为LcDXR。序列分析表明,LcDXR cDNA 全长为1 501 bp,5'非编码区长34 bp,3'非编码区长53 bp,开放阅读框长1 413 bp,预测编码含有470个氨基酸残基的蛋白质,等电点为6.62,分子量为51.12 kD。LcDXR 基因全长为12 601 bp,其中外显子12 个,内含子11 个。对来自10个种源的LcDXR 基因编码区单核苷酸变异位点进行分析表明:在cDNA 区间内共发现10 个SNP(single nucleotide polymorphism)位点,其中有4 个单核苷酸变异导致了所编码的氨基酸的改变,为了分析氨基酸突变导致的蛋白质精细结构的变化,利用Swiss-PDB Viewer 模拟4 个突变位点氨基酸残基的替换。其中江西安远(AY)的突变Lys119Thr 引起了氢键的变化,推测可能对酶的活性产生影响。研究结果为深入研究山鸡椒脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶的活性和功能奠定了基础,同时为山鸡椒遗传育种提供理论依据。     

淡紫拟青霉航天诱变菌株对南方根结线虫的致病力

[目的]为筛选对南方根结线虫具有高致病力的淡紫拟青霉航天诱变菌株,通过淡紫拟青霉山东寿光菌株搭载神舟八号获得10个淡紫拟青霉航天诱变菌株.[方法]以这10个航天诱变菌株对南方根结线虫卵进行寄生试实验,观察了其发酵液对南方根结线虫卵及二龄幼虫的作用,并对与毒力相关的胞外酶几丁质酶和蛋白酶活性进行了测定.在此基础上,通过盆钵试验方法, 检验菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26对花椒南方根结线虫的防治效果.[结果]结果表明:10个诱变菌株对南方根结线虫卵的寄生率与原始菌株存在分化,其中有3个诱变菌株的寄生率增强,即Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26;这10个诱变菌株的几丁质酶和蛋白质酶的活性与对南方根结线虫卵的寄生率之间呈正相关.在盆钵试验中,菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26对南方根结线虫的根结指数较原始菌株下降88.34%~89.70%.[结论]因此,航天诱变菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26可用于对南方根结线虫的防治.