携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

【背景】在中国,柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing,HLB）是由候选韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱（Diaphorina citri）体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju）的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘,分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌 6、12、18 d,利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群,分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周,移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量,每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度,利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异,但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常,出现均匀黄化、小叶的明显症状,而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现,在叶片病菌浓度相近的情况下,相比于接种了Type-1+3-CLas 的叶片,接种了Type-2-CLas菌株的叶片韧皮部细胞发生更严重的细胞塌缩,在叶脉和叶肉薄壁细胞内造成较多的淀粉粒积累。【结论】Type-2-CLas比Type-1+3-CLas更容易在柑橘木虱成虫体内增殖,且达到较高的病菌浓度,间接证明了Type-2-CLas菌株具有高传染性。感染Type-2-CLas的新叶呈现均匀黄化、叶小的症状,而感染Type-1+3-CLas的新叶呈现较为斑驳和革质化的症状,Type-2-CLas比Type-1+3-CLas造成更严重的叶脉韧皮部塌缩和淀粉粒积累情况,说明Type-2-CLas比Type-1+3-CLas对柑橘具有更强的致病力。     

山黄皮上柑橘木虱发生调查初报

【目的】明确山黄皮上是否有柑橘木虱为害,为开展山黄皮是否是柑橘木虱寄主研究奠定基础。【方法】采用面上调查和实地调查相结合的方法,对地处广西桂南的龙州县、宁明县及广西现代农业技术展示中心（南宁）的山黄皮、黄皮、柑橘上柑橘木虱发生情况进行调查。【结果】被调查的12个点中,广西现代农业技术展示中心的山黄皮上发现有柑橘木虱,其他调查点山黄皮上未发现有柑橘木虱。【结论】山黄皮上有柑橘木虱,但山黄皮是否是柑橘木虱的寄主尚待研究。     

南宁市柑橘木虱自然天敌种类调查

【目的】明确南宁市柑橘木虱（Diaphorina citri）自然天敌种类以及柑橘木虱数量与天敌数量的相关性,为利用天敌防控柑橘木虱提供科学依据。【方法】 2020年8月—2021年7月在广西大学农场多功能标本园内未喷施过化学农药的九里香绿篱和广西创新驱动专项基地内砂糖橘果树上采用随机取样法调查柑橘木虱自然天敌种类,统计捕食性天敌的数量及寄生性天敌的寄生率,每15 d调查1次。【结果】调查发现南宁市柑橘木虱的自然天敌共有15种,其中昆虫纲天敌9种,包括六斑月瓢虫（Menochilus sexmaculata）、龟纹瓢虫（Propylea japonica）、双带盘瓢虫（Lemnia biplagiata）、粗网巧瓢虫（Oenopia chinensis）、异色瓢虫（Harmonia axyridis）、中华草蛉（Chrysoperla sinica）、亮腹釉小蜂（Tamarixia radiate）、阿里食虱跳小蜂（Diaphorencyrtus aligarhensis）及豹纹花翅蚜小蜂（Marietta picta）;蛛形纲天敌6种,条纹金蝉蛛（Phintella vittata）、角红蟹蛛（Thomisus labefactus）、锈宽胸蝇虎（Rhene rubigera）、多色金蝉蛛（P.versicolor）、斜纹猫蛛（Oxyopes sertatus）及园果大赤螨（Anystis baccarum）。发现亮腹釉小蜂的1种寄生蜂黄食虱跳小蜂（Psyllaphycus diaphorinae）。【结论】南宁市柑橘木虱自然天敌共15种,主要捕食性天敌为六斑月瓢虫,主要寄生性天敌为亮腹釉小蜂。当地柑橘木虱自然天敌资源丰富,在田间应加强保护和合理利用,提高天敌对柑橘木虱的自然控制能力。     

山黄皮上柑橘木虱发生调查初报

【目的】明确山黄皮上是否有柑橘木虱为害,为开展山黄皮是否是柑橘木虱寄主研究奠定基础。【方法】采用面上调查和实地调查相结合的方法,对地处广西桂南的龙州县、宁明县及广西现代农业技术展示中心(南宁)的山黄皮、黄皮、柑橘上柑橘木虱发生情况进行调查。【结果】被调查的12个点中,广西现代农业技术展示中心的山黄皮上发现有柑橘木虱,其他调查点山黄皮上未发现有柑橘木虱。【结论】山黄皮上有柑橘木虱,但山黄皮是否是柑橘木虱的寄主尚待研究。     

亚洲韧皮杆菌在单株脐橙病树的分布情况

【目的】研究亚洲韧皮杆菌(CLas)在纽荷尔脐橙病树的分布情况,为柑橘黄龙病(HLB)的防控提供参考依据。【方法】以1~3个枝条表现斑驳黄化叶片症状的纽荷尔脐橙病树为研究对象,对主干发出的5个主枝(A、B、C为斑驳黄化枝条,D、E为无症状枝条)的叶片分别取样,运用PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测,用2~(-ΔΔCr)法分析树体各部分黄龙病菌含量。对于果树上表现典型HLB病果但叶片无症状的结果枝,分别检测典型病果和相应叶片的感病情况。【结果】PCR对A、B、C、D、E的阳性检出率分别为88.57%、61.11%、54.17%、6.67%和0,qPCR对A、B、C的阳性检出率均为100.00%,对D、E的阳性检出率分别为40.00%和13.33%;2~(-ΔΔCr)法分析发现,斑驳黄化叶片中病原菌含量更高,病果的阳性检出率高于相应的无症状叶片样品。【结论】CLas在表现典型斑驳黄化症状的叶片和果实中的含量及阳性检出率均较高,病原菌在病树中分布不均匀。在进行HLB检测时,应选取典型或疑似症状样品,并运用qPCR进行检测,一旦发现树体局部发病,应当整株销毁。     

高温对亚洲柑橘木虱死亡率和活动行为的影响

【目的】研究高温对亚洲柑橘木虱死亡率和活动行为的影响,为亚洲柑橘木虱的防治提供理论依据。【方法】在光照培养箱中模拟高温环境,研究40、42、44、45和46℃高温条件下亚洲柑橘木虱的死亡率;研究36~46℃逐渐升温对亚洲柑橘木虱活动行为的影响;在45℃下,研究不同光照对亚洲柑橘木虱死亡率的影响,以及36与45℃循环变温对亚洲柑橘木虱死亡率的影响。【结果】在40、42、44、45和46℃高温条件下50%亚洲柑橘木虱死亡时间(LT_(50))分别为138.038、17.140、11.695、10.593和0.337 h;95%亚洲柑橘木虱死亡时间(LT_(95))分别为181.970、26.978、18.843、14.718和0.500 h;在36~46℃逐渐升温过程中,亚洲柑橘木虱的活动逐渐增强;高温(45℃)条件下暗处理的LT_(50)和LT_(95)分别为6.353和8.913 h,均小于正常光照处理的10.593和14.718 h,而36与45℃循环变温的LT_(50)和LT_(95)分别为13.740和18.967 h,均大于恒温处理的10.593和14.718 h。【结论】高温导致木虱种群生存时间缩减是亚洲柑橘木虱在高温季节出现种群消退现象的主要原因。     

滴灌施用噻虫胺防治柑橘木虱研究

【目的】明确滴灌施药防治柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama的可行性,为田间控制柑橘黄龙病传播提供新的手段。【方法】通过室内模拟滴灌施用噻虫胺,测定了噻虫胺在土壤中的分布以及柑橘叶片中含量,研究了滴灌施药对柑橘木虱防治效果。通过田间试验,检测分析了柑橘叶片中噻虫胺含量。【结果】在室内条件下,一次滴灌施药对柑橘木虱的防治效果可长达4个月;噻虫胺在土壤中以滴头为起始点在土壤中呈半圆形迁移分布,当柑橘叶片中噻虫胺质量分数大于0.64 mg·kg–1时,对柑橘木虱的防治效果均高于80%。田间试验表明,在药后7～63 d柑橘上部叶片中噻虫胺的质量分数大于0.64 mg·kg–1。【结论】滴灌施用噻虫胺能有效防治柑橘木虱,是田间控制柑橘黄龙病传播的有效手段。     

基于改进 YOLOX 模型的柑橘木虱检测方法

【目的】黄龙病被称为柑橘的“癌症”，是一种毁灭性病害，而木虱是黄龙病传播的主要媒介， 对木虱的监测和精准消杀是防控黄龙病及抑制其传播的一种有效途径。【方法】传统方式消灭木虱主要是靠人 工喷洒药物，人力成本高但防控效果并不理想。采用基于改进 YOLOX 的木虱边缘检测方法，在主干网络加入卷 积注意力模块 CBAM（Convolutional block attention module），在通道和空间两个维度对重要特征进行进一步提取； 将目标损失中的交叉熵损失改为使用 Focal Loss，进一步降低漏检率。【结果】本研究设计的算法契合木虱检测 平台，木虱数据集拍摄于广东省湛江市廉江红橙园，深度适应农业农村实际发展需要，基于 YOLOX 模型对骨干 网络和损失函数做出改进实现了更加优秀的柑橘木虱检测方法，在柑橘木虱数据集上获得 85.66% 的 AP 值，比 原始模型提升 2.70 个百分点，检测精度比 YOLOv3、YOLOv4-Tiny、YOLOv5-s 模型分别高 8.61、4.23、3.62 个 百分点，识别准确率大幅提升。【结论】改进的 YOLOX 模型可以更好地识别柑橘木虱，准确率得到提升，为后 续实时检测平台打下了基础。     

印楝素对柑橘木虱的毒力测定及田间防效试验

【目的】评价印楝素对柑橘木虱(Diaphorina citri)的室内毒力与田间防效,为柑橘木虱的生物防治提供科学依据。【方法】采用浸叶法和喷雾法测定印楝素对柑橘木虱三龄若虫和成虫的室内毒力及田间防治效果。【结果】在室内印楝素处理柑橘木虱三龄若虫1、3、7 d后LC_(50)值分别为2.77、1.14、0.61 mg/L;而16.0 mg/L印楝素处理木虱成虫4 d后死亡率仅为13.33%,与清水对照无显著差异。0.3%印楝素乳油800倍液喷雾处理后 1、3、7 d 对柑橘木虱田间防效分别为14.35%、49.56%和86.4%。【结论】印楝素对柑橘木虱若虫具有良好的毒杀活性,药后7 d 防治效果较好,但对成虫没有毒杀活性;印楝素在柑橘木虱若虫防治上具有良好的应用前景。     

柑橘木虱成虫繁殖行为前期及活动规律研究

【目的】明确柑橘木虱[Diaphorina citri(Kuwayama)]雌雄成虫交配前期和雌虫产卵前期的时长及成虫交配、产卵和羽化的昼夜节律,为探索更经济、有效和环保的柑橘木虱防控措施和性诱防控技术提供参考。【方法】采用活体九里香幼苗和成株为试验材料,以自制塑料杯及养虫笼为试验载具,在室内控制环境条件及室外自然状态下对柑橘木虱成虫的繁殖行为进行观察,记录柑橘木虱成虫繁殖行为前期及繁殖行为昼夜节律数据。【结果】柑橘木虱雌雄成虫的交配前期分别为10.64±2.25和9.84±1.79 d;雌虫的产卵前期为12.58±2.90 d。成虫交配、产卵和羽化活动主要在2:00—21:00进行,其活动高峰期分别为9:00—10:00、11:00—12:00和9:00—10:00。【结论】柑橘木虱雌雄成虫交配、雌虫产卵和若虫羽化集中在白昼进行,雌雄成虫交配前期和成虫羽化日节律存在两性差异现象。可根据柑橘木虱成虫繁殖行为日节律的特点对其进行防治及预测预报。     

云南柑橘黄龙病病原检测及其 １６ＳｒＤＮＡ序列分析

利用柑橘黄龙病菌的特异引物，对采自云南红河州建水县和个旧市、玉溪市华宁县、大理州宾川县、昭通市盐津县、德宏州瑞丽市以及保山市隆阳区等地共 １５１个疑似柑橘黄龙病样品进行了黄龙病菌的检测，其中建水县有 ５个样品检测结果为阳性，检出率为 ３３３％；个旧市、华宁县和宾川县各有 １个样品为阳性，检出率分别为 ８.３％，５.５％，６.７％；而昭通、德宏和保山的样品均为阴性。表明黄龙病在云南的主要柑橘产区建水、个旧、华宁和宾川均有不同程度的发生，其中建水县发生率较高，生产上应尽快引起重视。对所获得的黄龙病菌 １６ＳｒＤＮＡ进行了克隆和序列测定，发现 ８个云南柑橘黄龙病菌 １６ＳｒＤＮＡ的序列一致性均为１００％，与柑橘黄龙病菌亚洲种 （ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒａｓｉａｔｉｃｕｓ）相应序列的一致性为 ９８.７％ ～１００％，与柑橘黄龙病菌非洲种 （ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒａｆｒｉｃａｎｕｓ）的一致性为 ９７.５％ ～９８.７％，而与柑橘黄龙病菌美洲种（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）的一致性均为 ９６.５％。表明云南主要柑橘产区发生的黄龙病菌均属于柑橘黄龙病菌亚洲种。     

台州柑橘黄龙病亚洲种及亚洲柑橘木虱防控研究

文章主要回顾阐述2002—2017 年台州对柑橘黄龙病亚洲种和亚洲柑橘木虱防控研究结果。指出黄龙病在果园空间分布入侵初期呈均匀分布，后呈聚集分布，亚洲柑橘木虱在果园内也呈聚集分布状态；认为黄龙病对柑橘产量与品质影响是随着病级的上升增加。得出黄龙病疫情自然入侵扩散流行呈周期性变化规律，建立积年发病率(PI)与入侵年数(N)模型I=84.6740/[1+EXP(3.540-0.5838X)](n=14，r=0.9946**)；检测发现黄龙病树体内和亚洲柑橘木虱带菌量在11 月和12 月最高，亚洲柑橘木虱带菌率同样以12 月最高。提出防治亚洲柑橘木虱除抓好春夏秋三梢期外，冬季和初春清园也是一个重要环节。台州探索实践的“九坚持”和“三防五关”防控模式对黄龙病防控和柑橘产业的可持续发展起到了积极作用，可在相似柑橘生态区推广应用。     

广西砂糖橘黄龙病亚洲种的Nested—PCR检测

【目的】利用柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物检测疑似黄龙病的砂糖橘叶片样品,为砂糖橘黄龙病的综合防控提供理论依据。【方法】选取采自广西9市17个采样点的214份疑似黄龙病及无症状砂糖橘叶片样品,用试剂盒法提取叶脉基因组DNA,采用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物进行PCR扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计待检样品柑橘黄龙病病原菌亚洲种的带菌率。【结果】对214份样品的Nested-PCR扩增结果,部分样品可得到1160 bp左右的特异条带,与预期大小相符但条带明暗不同。来自广西9市17个采样点的砂糖橘叶片样品均检测出黄龙病亚洲种病原,平均检出率均在66.0%以上,其中检出率最高的是来自东兴市的样品,检出率为100.0%,检出率最低的是来自南宁市的样品,检出率为66.9%;斑驳、缺素型黄化、叶脉黄化、小叶和无症状叶片样品中均可检测出黄龙病亚洲种。【结论】Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原,可用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列的克隆及分析

 【目的】克隆柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列并和亚洲种相应区域进行比对，阐明黄龙病3个种核糖体RNA操纵子之间的关系。【方法】根据亚洲种23S-5S rRNA基因区域序列的保守性设计引物，在非洲种和美洲种DNA样品上扩增，对PCR产物进行克隆和测序，并对新获得的序列进行序列验证和分析。【结果】 非洲种获得了3 057 bp 序列包括23S rRNA 基因、细胞壁脱氢酶假基因和5S rRNA 基因；美洲种获得了3 033 bp序列包括23S rRNA 基因、glpK基因和5S rRNA 基因。3个种核糖体基因顺序分别是：亚洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因、5S rRNA 和 tRNAMet；非洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因和 5S rRNA；美洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、glpK 基因和5S rRNA。【结论】黄龙病病原菌核糖体RNA基因有特殊的排列方式，即在23S rRNA和5S rRNA基因区间均有反向编码的细胞壁脱氢酶基因，其中亚洲种和非洲种为假基因，美洲种为glpK基因。     

柑橘木虱黄龙病菌携带量与其内生菌群相关性

【目的】分析柑橘木虱（Diaphorina citri）体内可能与黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）互作的内生细菌,为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌（带菌）和不带菌黄龙病菌（不带菌）的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分,经PCR扩增其16S rDNA的V6—V8区,用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法,比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌：Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析,再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量,数据经LSD检验,以各种细菌相对含量的-lg值作图,先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系,再比较同种细菌在不同样品中的特性,分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株,分属于芽孢杆菌属（Bacillus,3株）、欧文氏菌属（Erwinia,1株）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella,1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus,2株）、节杆菌属（Arthrobacter,1株）、泛菌属（Pantoea,2株）、果胶杆菌属（Pectobacterium,1株）、沙门氏菌属等（Salmonella,1株）、链霉菌属（Streptomyces,1株）、Massilia brevitalea（1株）等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到,分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11（嗜气芽孢杆菌属）在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%,表明其为木虱体内常驻细菌;对木虱不同部位（头、胸、腹）内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示,带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显,带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 （Wolbachia sp.）、12（Wolbachia pipientis）、13（Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri）、14（Uncultured bacterium）、19（Serratia marcescens）、21和22（均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）在木虱体内稳定存在,带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.,木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性,同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构;嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）在柑橘木虱体内稳定存在,为木虱体内常驻菌群;Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关,推测其可能与黄龙病菌互作。     

Decreasing detection frequency of MITE(MCLas-A) in the population of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus' recently collected in southern China

An active miniature inverted-repeat transposable element(MITE), MCLas-A, was previously identified from ‘Candidatus Liberibacter asiaticus' known to be associated with citrus Huanglongbing(HLB, yellow shoot disease). To explore the recent transposition status of MCLas-A, 389 ‘Ca. L. asiaticus' strains collected from nine regions in China were amplified using a specific primer set and three representative ‘Ca. L. asiaticus' strains were analyzed by next-generation sequencing(NGS) approach. PCR and genomic analysis showed that the entire MCLas-A was only present in 1.80%(7/389) and the jumping-out type of the MITE was predominant(81.23%) in samples tested, suggesting high frequency transposition occurred in ‘Ca. L. asiaticus' strains recently collected from China. Biological roles of transposition of the active MITE remain to be determined.     

基于SSR标记的中国亚洲韧皮杆菌种群结构研究

【目的】亚洲韧皮部杆菌是柑橘黄龙病病原。通过筛选SSR（Simple sequence repeat）位点,分析中国境内亚洲韧皮部杆菌（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’）的群体结构。【方法】根据已报道亚洲韧皮部杆菌基因组上的25个SSR位点,使用中国不同地理来源的样品,对报道的SSR位点进行筛选,找出其中适宜进行中国样品群体结构分析的位点。应用PCR的方法,对收集的中国境内的285个亚洲韧皮部杆菌相应SSR位点进行扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳。所得电泳图导入软件Quantity One 4.5.0读取产物的碱基数。通过PopGen version 1.31软件评估选出的位点和不同地理来源的样品的多态性,分别使用软件Powermarker 3.25和structure 2.3.4进行聚类分析。【结果】共选出5个SSR位点可用于中国种群结构研究,Nei''s多样性指数0.1542—0.9556。其中LasA位点多态性最高,有效等位基因数NE=22.5,Nei''s多样性指数H=0.9556。通过这5个位点分析中国境内8个不同地理来源的样品,发现云南省样品存在较高多态性,NE=5.7,H=0.6580。8个地理种群间的遗传距离0.0236—0.5786,遗传相似度0.5607—0.9767,广西和四川遗传距离最大,遗传相似度最小。Powermarker软件以UPGMA方法进行聚类分析的结果显示,所有样品分为两个组群,四川和云南为一个组群;福建、浙江、贵州、广东、广西和江西为一个组群。Structure软件分析也得出了相似的结果,云南和四川样品的种群构成较为单一,90%以上个体为同一组群,而其他6个地理来源不同程度的为两个组群的混合。【结论】基于5个SSR位点分析中国境内的Ca. L. asiaticus表明其可能存在两种不同的群体结构,为进一步研究中国柑橘黄龙病的发生和流行规律提供了有价值的线索。