新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

【目的】通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体。构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化。【结果】AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2~1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异。但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低。【结论】构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

两种早春短命植物CBF基因的原核表达分析

【目的】在原核表达系统中高效表达真核生物中与抗寒相关的转录因子CBF基因,验证序列的正确性,摸索高效表达的条件,为后续转录因子的功能验证奠定基础。【方法】以具有耐低温胁迫的两种早春短命植物绵果荠和卷果涩荠为材料,扩增两端有NcoⅠ和Hind III酶切位点的Ll CBF和Ms CBF基因的CDS全长,构建原核表达载体p ET32a-Ll CBF和p ET32a-Ms CBF,并将其转入Rosetta(DE3)菌株,进行了15、25、30和37℃下不同IPTG浓度的诱导表达;选择表达量最大时的温度及IPTG浓度进行不同时间的诱导表达;对高效表达条件下收集的菌体沉淀超声破碎,离心后同时收集上清和沉淀并进行煮沸处理,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白可溶性。【结果】Ll CBF蛋白在30℃、IPTG浓度1 mmol/L、20 h表达量达到最大,Ms CBF蛋白在30℃、IPTG浓度2 mmol/L、20 h达到最大表达量。【结论】探索出了在原核表达系统中高效表达目的蛋白的最适条件,Ll CBF蛋白和Ms CBF蛋白表达形式均为包涵体。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

猪囊尾蚴API基因原核表达条件的优化

【目的】获得猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂(API)基因在大肠杆菌中的最佳表达条件,为API功能研究奠定基础。【方法】以表达载体pEGX-4T-1、pET-30a及猪囊尾蚴API基因的原核表达载体pEGX-4T-1/API-Flag、pET-30a/API为材料,对影响API蛋白表达的载体(pEGX-4T-1、pET-30a)、温度(25,30,37℃)、诱导时间(2,4,6,8h)、IPTG终浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和卡那霉素终浓度(100,200,300,400mmol/L)等条件进行优化,筛选重组蛋白最佳的表达条件。对在最佳条件下获取的目的蛋白进行超声处理,4℃、10 000r/min离心分别收集上清液和沉淀,对目的蛋白进行可溶性分析;SDS-PAGE后,将目的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上,与抗His标签抗体共孵育,检测目的蛋白的反应原性。【结果】当选择pET系列载体(pET-30a)时,API表达量高于其在pGEX系列(pGEX-4T-1)中的表达量。API融合蛋白最佳表达条件为:在含200mmol/L卡那霉素的LB培养基上于37℃培养3h后,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG,再于30℃诱导培养6h。SDS-PAGE结果表明,pET-30a/API融合蛋白分子质量约为53ku,与预期蛋白分子质量一致。Western-blot检测结果显示,重组蛋白pET-30a/API能够识别特异性抗体,显示获得了大量表达正确的目的蛋白。【结论】确定了API基因的最佳表达条件,获得了较大表达量的API融合蛋白。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

牦牛SRY蛋白表达条件的优化

将含有天祝白牦牛SRY基因编码区的原核表达载体pET-28a/SRY转入E.coliBL21(DE3)中,在通用条件下诱导表达;同时用Western-blot对表达产物进行检测;在不同温度、诱导时间和IPTG浓度下对表达条件进行优化。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在31℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,SRY蛋白表达量最高。     

拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化,并免疫家兔,获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体,为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥PAC蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化,并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔,利用分离得到的抗血清,针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACOE的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC,在37℃、1mmol/L IPTG诱导4h的大肠杆菌细胞中,可检测到分子质量为38.9ku的重组蛋白,其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清,该抗血清能够有效地检测出1ng原核表达的PAC重组蛋白,并在植物样品中检测出1条分子质量约为35ku的条带。【结论】成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体,可用于植物中PAC蛋白含量的检测。     

鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)重组表达条件的优化

为获得更高含量的可溶性N蛋白,对构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-32a-N)的表达条件(如诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行了优化.结果表明:N蛋白最佳诱导表达条件为18℃诱导17h、IPTG浓度0.2 mmol/L;优化后可溶性N蛋白的表达量为22.1 mg/L,比优化前37℃、IPTG浓度1.0 mmol/L条件下诱导4h提高了58.5％.     

语篇修辞策略的负迁移

通过非计划写作、计划写作和自发口语的话语对比分析,探究英语学习者语篇修辞策略的特点———归纳形式,并从礼貌策略的面子顾虑出发分析归纳形式产生的原因,目的是强调语篇修辞策略的重要性。     

光和生物双降解地膜在生产中应用试验研究

地膜的应用促进了生产的发展，但是由于大量地膜残留，造成农业环境污染，影响了农业可持续发展。光和生物双降解地膜在光和生物的作用下自行降解，从根本上解决了农用地膜残留问题。光和生物双降解地膜在作物生长期内，可有效提高土壤温度和土壤水分含量，促进作物生长发育，对提高作物产量有显著作用。     

新型无接触电能传输系统多负载解耦控制研究

利用无接触感应耦合电能传输系统互感数学模型,研究了多负载时系统的功率传输问题.提出了一种解耦控制策略,在能量拾取侧中增加一个Boost电路.在负载轻载时,以较低开关频率控制Boost电路中功率开关管的通断.当功率开关管关断时,系统向负载传输功率;当功率开关管导通时,系统屏蔽副边负载,实现原边线圈与副边线圈的解耦控制.针对系统有无Boost电路分别进行了PSpice仿真分析.理论分析与仿真结果表明,该控制方法能在多负载系统的单一负载轻载时实现副边线圈与原边线圈的电磁解耦,为多负载无接触感应耦合电能传输系统的稳定运行提供保障.     

桃遗传转化再生体系的建立与优化

以桃不同胚龄胚为外植体,建立桃遗传转化再生体系.结果表明:花后50 d的胚均能诱导出愈伤组织,并可分化出不定芽.胚愈伤组织诱导培养基以MS+6-BA0.25 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L的效果最好,平均诱导率可达99.8%.将胚愈伤组织接种在培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上,愈伤组织转变为致密型,不定芽分化率为37.5%.将不定芽用100 mg/LIBA浸蘸其基部转移到不含激素的1/2 MS培养基中诱导生根,生根率为82.0%.花后75d的成熟胚不定芽的直接诱导率达到96.1%.     

筛选北五味子愈伤组织诱导中不同因素的最佳条件

为筛选北五味子组织培养中愈伤组织诱导的最佳条件,以叶片、叶柄、茎为外植体,探讨不同因素中不同条件对北五味子组织培养中愈伤组织诱导的影响.结果表明:0.1%HgCl2适合作为北五味子的消毒剂,其中叶片、叶柄和茎的最佳消毒时间为6 min、6min和10 min.叶片、叶柄、茎3个外植体的最适基本培养基分别为MS、B5和N...     

几种常见的数学论证方法

在数学教学与学习过程中 ,我们常常需要对某一命题或结论加以证明 ,而牵扯到证明的问题 ,许多人不知从何下手 ,本文简要介绍几种常见的数学论证方法     

化学杂交剂BAU—2诱导春小麦雄性不育的研究

连续两年的试验结果表明:BAU-2对供试各品种(系)均有诱导雄性不育效果,不育率>95%;用0.2%,0.3%浓度的 BAU-2在小麦花粉的母细胞形成期至减数分裂期喷施效果最佳,人工饱合授粉结实率为53.0%,天然异交结实率为47.8%;喷药后,小麦抽穗推迟2～4天,株高略有降低。     

计算机房供电系统的布线及维护

计算机房供电系统的负载主要有 2种:容性负载和感性负载,前一种为主要负载.现计算机主机及外设均采用偏容性负载的无工频变压器开关电源.由于容性负载对供电系统的开关、中线有特殊要求,为了保证计算机系统长期、可靠地运行以及机房的安全,本文介绍了计算机房供电系统的合理布线和维护方法.     

人工诱导下观赏植物的阶段转变类型及幼年期的确定

花期调控需要有效的人工诱导。在植物的幼年期，任何诱导都是无效的，因此，需要确定结束其的时间。本文对用于判断幼年期的量化指标、判断准则和常规步骤等进行了总结，确定了常用的标准。被诱导的阶段转变指的是人工诱导下植物从幼年期向成熟期的转变过程。本文归纳出五种被诱导的阶段转变的基本类型，对每种类型的特征进行了描述和举例，确定了幼年期结束的判断方法，讨论了影响判断的因子及长期存在的争议。     

寄主诱导剂对大白菜幼苗抗软腐病的诱导效应研究

利用寄主诱导剂处理大白菜幼苗,测定幼苗体内多酚氧化酶(PPO)与苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性,同时测定幼苗体内木质素和总酚含量。结果表明:大白菜幼苗体内PPO与PAL的活性均比对照明显提高(P<0.05),幼苗体内木质素和总酚含量也出现不同程度的累积。诱导剂处理能显著增强大白菜对软腐病的抗性,而且主要是通过提高幼苗体内与抗病性相关的酶的活性以及幼苗体内木质素和总酚含量来实现的。