小麦锌指蛋白基因TaZAT6的克隆、特征分析及其在不同磷水平下的表达

 【目的】在克隆小麦锌指蛋白基因TaZAT6的基础上,深入研究该基因的分子特征和在不同磷水平下的表达特性。【方法】通过对富集石新828不同低磷胁迫时间点特异表达基因的cDNA差减文库克隆测序,获得1锌指蛋白型转录因子基因EST。利用RT-PCR技术,在低磷处理24 h的石新828和冀7369根系中克隆了该锌指蛋白基因TaZAT6,并采用该技术进一步研究该基因应答介质中Pi的特征。【结果】TaZAT6开放阅读框为717 bp,编码238个氨基酸残基,编码的蛋白质中含有1个保守的核定位区、2个C2H2锌指蛋白域和1个DLN保守盒。系统进化分析表明,TaZAT6可能与另外2个小麦锌指蛋白基因ZAT22和ZAT23具有共同的祖先。TaZAT6的表达表现为明显的低磷诱导特性,恢复至正常磷水平下其表达降低至磷胁迫前水平。与磷低效品种冀7369相比,石新828根叶中TaZAT6具有更强应答低磷胁迫能力。小麦高亲和磷转运蛋白基因TaPT2对生长介质中Pi的响应特点与TaZAT6相似,表明TaZAT6可能参与了对TaPT2的转录调节。【结论】低磷胁迫条件下,石新828中 TaZAT6具有较强应答Pi能力,由此进一步调控下游基因表达,可能与该品种在低磷下表现磷高效具有密切联系。     

小麦磷转运蛋白基因TaPT2的转录调控特征研究

在富集低磷逆境的根系cDNA差减文库中,获得了与小麦磷转运蛋白基因TaPT2具有相同序列的表达序列标签(EST).TaPT2的表达呈根系特异性,对外界低磷逆境呈明显应答,表明该基因在小麦抵御外界低磷逆境中可能发挥重要作用.采用基因组行走技术,克隆了长度为1 300 bp的TaPT2启动子,该启动子含有保守TATA盒、C...     

杉木磷转运蛋白ClPht1;2基因克隆与表达特性分析

磷酸转运蛋白PHT1家族是介导植物磷素吸收与转运分配的重要基因家族。从第3代杉木优良无性系洋061中克隆获得1个杉木磷转运蛋白ClPht1;2,并对不同程度磷胁迫下ClPht1;2的时空表达进行分析,为了解杉木磷转运蛋白基因结构和功能表达奠定基础。以转录组测序获得的ClPht1;2核心序列为基础,以杉木洋061无性系根系cDNA克隆为模板,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆目的基因的全长,采用实时荧光定量PCR技术,检测了杉木洋061无性系在不同组织中ClPht1;2的表达,以及磷饥饿诱导3、10、25 d下ClPht1;2在根中的表达量变化。克隆得到1个杉木PHT1家族基因ClPht1;2(GeneBank登录号:MK450598)。ClPht1;2编码氨基酸序列与日本柳杉磷转运蛋白家族基因编码氨基酸序列相似性为93%,与马尾松、油茶、毛果杨等植物磷转运蛋白家族基因的编码氨基酸序列比对,结果相似性均72%。ClPht1;2基因序列编码区长1 565 bp,编码511个氨基酸,蛋白理论分子量60.024 ku,为疏水蛋白,不具有信号肽,潜在磷酸化位点42个。ClPht1;2所编码蛋白质由12个跨膜结构组成,其中11个为确定跨膜域,多肽链中α螺旋占42.65%,无规则卷曲占42.11%,延伸链占15.25%。ClPht1;2在杉木洋061无性系的根、茎、叶中均有表达,在叶片中的表达量最高,在根中的表达量最低。与正常磷供应相比,根系ClPht1;2的表达水平在低磷胁迫10 d时显著增加,到25 d时下降至正常磷供应时的表达水平;ClPht1;2在无磷胁迫处理3 d时表达量降低,在10 d时表达量显著提高,在25 d时表达量又低于正常供磷水平。ClPht1;2基因具有PHT1基因家族特征结构,在杉木不同组织中均有表达,在杉木根中的表达受低磷胁迫诱导,在叶中的表达量受低磷胁迫诱导不明显,可能为杉木体内低亲和的磷转运蛋白,参与杉木地上部和根中磷的运输和分配。     

杉木磷转运蛋白ClPht1;2基因克隆与表达特性分析

磷酸转运蛋白PHT1家族是介导植物磷素吸收与转运分配的重要基因家族。从第3代杉木优良无性系洋061中克隆获得1个杉木磷转运蛋白ClPht1;2，并对不同程度磷胁迫下ClPht1;2的时空表达进行分析，为了解杉木磷转运蛋白基因结构和功能表达奠定基础。以转录组测序获得的ClPht1;2核心序列为基础，以杉木洋061无性系根系cDNA克隆为模板，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆目的基因的全长，采用实时荧光定量PCR技术，检测了杉木洋061无性系在不同组织中ClPht1;2的表达，以及磷饥饿诱导3、10、25 d下ClPht1;2在根中的表达量变化。克隆得到1个杉木PHT1家族基因ClPht1;2（GeneBank登录号:MK450598）。ClPht1;2编码氨基酸序列与日本柳杉磷转运蛋白家族基因编码氨基酸序列相似性为93%，与马尾松、油茶、毛果杨等植物磷转运蛋白家族基因的编码氨基酸序列比对，结果相似性均>72%。ClPht1;2基因序列编码区长1 565 bp，编码511个氨基酸，蛋白理论分子量60.024 ku，为疏水蛋白，不具有信号肽，潜在磷酸化位点42个。ClPht1;2所编码蛋白质由12个跨膜结构组成，其中11个为确定跨膜域，多肽链中α螺旋占42.65%，无规则卷曲占42.11%，延伸链占15.25%。ClPht1;2在杉木洋061无性系的根、茎、叶中均有表达，在叶片中的表达量最高，在根中的表达量最低。与正常磷供应相比，根系ClPht1;2的表达水平在低磷胁迫10 d时显著增加，到25 d时下降至正常磷供应时的表达水平；ClPht1;2在无磷胁迫处理3 d时表达量降低，在10 d时表达量显著提高，在25 d时表达量又低于正常供磷水平。ClPht1;2基因具有PHT1基因家族特征结构，在杉木不同组织中均有表达，在杉木根中的表达受低磷胁迫诱导，在叶中的表达量受低磷胁迫诱导不明显，可能为杉木体内低亲和的磷转运蛋白，参与杉木地上部和根中磷的运输和分配。     

小麦bHLH型转录因子TaHLH1的分子特征和表达特性研究

利用cDNA-AFLP技术,鉴定了1个对低磷胁迫逆境产生明显应答的小麦bHLH型转录因子转录本片段(TDF)。比对分析表明,该TDF(TaHLH1 EST)与前人在水稻中鉴定的对低磷产生明显应答的bHLH型转录因子基因OsPTF1高度同源。利用生物信息学技术,获得了TaHLH1 EST对应的cDNA序列。TaHLH1的cDNA全长为2 209bp,含有1个编码480个氨基酸残基的开放阅读框。TaHLH1含有bHLH型转录因子具有的Basic-Helix-Loop-Helix保守基序,分别由13,15,6和22个氨基酸残基组成。比对分析表明,TaHLH1与源于水稻、大麦和玉米的同源基因编码蛋白在保守基序的氨基酸组成上高度同源。TaHLH1对低磷、低氮、干旱和高盐等逆境明显应答,但对低钾、低钙、脱落酸(ABA)和低温不产生应答。研究表明,TaHLH1是小麦bHLH型转录因子家族的重要成员,在介导低磷等非生物逆境的信号转导中可能发挥着重要作用。     

小麦植酸酶基因TaPHY1的克隆、分子特征和表达特性研究

利用小麦植酸酶基因PAPhya1进行同源查找,获得1个与该基因高度同源、尚未开展分子特征和生物学功能研究的小麦新型植酸酶基因TaPHY1.TaPHY1的全长cDNA序列为1771 bp,编码548个氨基酸残基,TaPHY1含有紫色酸性磷酸酶(PAP)类植酸酶通常含有的保守域Metallophos、Purple acid...     

菌根化马尾松磷转运蛋白家族基因的生物信息学和表达分析

利用同源克隆法从菌根化马尾松中获得14条磷转运蛋白基因片段,对其中6条(PmP1~PmP6)编码的氨基酸序列进行了比对和同源性分析,检测了不同磷水平下各成员的表达模式.结果表明,PmP1~PmP6编码氨基酸序列具有Pht1磷转运蛋白家族的典型特征,成员间相似性达70%以上.系统分析表明,它们分为5个亚组,与双子叶植物的同源性较高,且高度进化保守.综合分析半定量和荧光定量PCR结果显示,PmP1~PmP6的表达受外生菌根诱导,且根、茎和针叶中均有表达.未接种菌根真菌时,PmP1~PmP6在针叶中表达量最高,其次为根;接种后,根中表达活性升高,其表达量与生长环境中磷水平相关,低磷条件下被高效激活,高磷条件反而抑制其表达.因此,PmP1~PmP6参与菌根化马尾松体内磷的吸收和转运过程.     

响应低磷胁迫的小麦MDP激酶基因TaMPK1a-1的克隆和表达分析

 【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）基因TaMPK1a-1为基础，开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术，鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征，采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2 170 bp，开放阅读框为1 737 bp，编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下，磷高效品种石新828和磷低效品种冀7369根叶中均检测不到TaMPK1a-1的转录本;低磷处理下，TaMPK1a-1的表达在上述品种的根叶中均受到明显诱导。与冀7369相比，低磷条件下石新828根叶中TaMPK1a-1的转录本明显增多。【结论】TaMPK1a-1级联转导途径不仅影响着小麦对低磷信号的响应，而且对于增强小麦适应低磷胁迫的能力中也可能具有重要作用。     

马唐炭疽菌Colletotrichum hanaui三类Gα亚基基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,首先克隆马唐炭疽菌Gα亚基基因的同源片段,再通过TAIL-PCR扩增基因片段的上下游邻接序列,经过序列拼接最终成功获得了3类Gα亚基基因cagA,cagB和cagC的全长序列。根据基因序列及CDS序列,运用相关生物学软件对基因序列及其推测蛋白进行了生物信息学分析。基因cagA全长1 380 bp,含5个内含子,编码355个氨基酸;cagB全长1 283 bp,含3个内含子,编码353个氨基酸;cagC全长1 382 bp,含4个内含子,编码354个氨基酸。蛋白同源分析表明,该菌的这3类基因推测蛋白与稻瘟病菌、小麦赤霉病菌中同类基因编码蛋白高度同源,同源率均在75%以上,最高可达99%。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

甜菜M14 品系BvM14-STPK 基因的生物信息学分析及 响应盐胁迫的表达分析

旨在进一步研究BvM14-STPK蛋白激酶对盐胁迫的应答反应。本研究以甜菜M14品系为材料，使用特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增，获得BvM14-STPK基因cDNA全长，并进行生物信息学分析，采用荧光定量PCR探究该基因响应盐胁迫的表达分析。生物信息学分析结果表明，BvM14-STPK基因cDNA全长1668 bp，包含1527 bp的最大ORF，编码508个氨基酸；BvM14-STPK蛋白激酶具有典型的蛋白激酶保守结构域。实时荧光定量PCR结果表明，BvM14-STPK基因在甜菜M14品系叶、根中均有广泛表达，叶中的表达量高于根中。该基因在200、400 mmol/L NaCl处理下，在叶片和根中呈现不同的表达状态，表明该基因可以应答盐胁迫，但在不同组织中应答盐胁迫的表达量存在差异。本项研究对挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要指导意义，为后续进一步开展甜菜遗传改良工作奠定基础。     

小麦根高亲和NO_3~-转运体全长基因(TaNRT2.1)的克隆和鉴定

 在前期获得的 pTaAF 的工作基础上,采用 RACE 方法进一步克隆和鉴定了小麦根 NO3 转运体全长基因-(TaNRT2.1)。将TaNRT2.1和已知的硝态氮转运体基因家族进行同源性比较,指出TaNRT2.1属于HATS中的NRT2家族。Southern　印迹揭示小麦基因组中有1个TaNRT2.1拷贝。Northern　分析示出硝态氮可瞬时诱导TaNRT2.1　mRNA积累,NO 处理 1 h　TaNRT2.1　mRNA很快增加,4　h 达到最大,24　h恢复至诱导前水平,具根专一表达特点。 - 3     

小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。