水稻类黄酮3''-羟化酶基因克隆及植物表达载体的构建

参考GenBank中发布的水稻品种日本晴位于10号染色体的F3’H基因序列设计特异引物,用PCR方法从水稻基因组中克隆F3’H基因片段,并将该片段克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析。结果表明,克隆的F3’H基因全长1 789 bp,GenBank登录号为HQ876708,该基因与日本晴基因组序列同源性为100%。分别将F3’H基因插入植物双元表达载体pPZP2Ha3(-)和pPZP2Ha3(+)中,获得F3’H基因正义和反义植物表达载体,同时转入根癌农杆菌中。该研究为利用农杆菌介导法转化F3’H基因,进一步研究F3’H基因功能奠定基础。     

汉中黑稻黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的遗传变异分析

本实验通过PCR和测序拼接获得汉中地区8个黑稻品种黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)编码区序列,在NCBI中用BLAST分析首次发现该基因位于水稻4号染色体。发现8种黑稻和普通籼稻F3H序列完全相同,与粳稻相比较,则存在4个突变位点,导致2个氨基酸突变。基于F3H序列信息的进化树表明黑稻与籼稻、粳稻、小麦、玉米的亲缘关系较近;遗传距离和同源性分析表明F3H基因较为保守,是一个古老的基因,可用于种属的鉴定分析。F3H蛋白理化性质分析发现,黑稻与其它禾本科植物存在一定差异,蛋白三维结构及相关位点预测发现粳稻和黑稻无明显差异,初步认为黑稻F3H序列变异可能与花青素的合成无关,需要在其表当量与花青苷和成合成与沉积的关系方面开展进一步研究。     

CiF3H基因克隆及功能分析

黄烷酮-3-羟化酶(F3H)是类黄酮合成途径的中枢位点,调控代谢途径中黄酮醇和花青素合成。文章根据转录组数据库中F3H基因中间片段设计特异引物,以中间锦鸡儿cDNA为模板,克隆得到CiF3H基因全长,通过序列分析、系统进化分析加以确认。qRT-PCR检测分析发现,中间锦鸡儿CiF3H基因受紫外、NaCl和ABA等胁迫诱导时表达模式具有相同规律。CiF3H基因在叶和根中表达量相当,茎中较少。异源表达CiF3H基因拟南芥的总黄酮含量少量增加,花青素含量降低。     

石榴花类黄酮3′羟化酶基因的克隆及序列分析

为研究花色苷生物合成途径中类黄酮3′羟化酶基因(F3′H)的序列信息,以泰山红石榴花瓣为试材,提取总RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中登录的相关物种F3′H基因的保守序列设计兼并引物,对反转录后的cDNA进行PCR扩增并测序。结果表明:在石榴中克隆到了长度为996bp的F3′H基因cDNA片段,该基因编码331个氨基酸,含有细胞色素P450保守域,属于CYP75B亚家族。该序列在GenBank中的登录号为KC430328。     

核桃黄烷酮3-羟化酶基因cDNA 3′端的克隆与序列分析

从核桃(Juglans regia)中首次克隆得到黄烷酮3-羟化酶基因的cDNA片段,并命名为JrF3H,GenBank登录号为FJ966204.JrF3H长1 029 bp,编码342个氨基酸.蛋白质序列多重比对结果表明,推导的JrF3H蛋白质与其他植物F3H蛋白质具有很高的相似性,JrF3H蛋白质与茶学、拟南芥、大豆、烟草、小麦和银杏F3H蛋白质序列的同源性分别为86%、85%、85%、82%、80%和79%.此外,JrF3H在相似的位置存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点.F3H系统进化树表明,JrF3H与乔木类植物的F3H基因聚类关系最近.JrF3H基因的克隆将有助于弄清该基因在核桃黄酮代谢途径中所起的作用.     

山葡萄花色苷生物合成结构基因F3′H和F3′5′H的表达

为阐明山葡萄次生代谢产物生物合成意义,以山葡萄双优果实为材料,应用HPLC-MS/MS技术,研究其果实发育过程中果皮花色苷生物合成结构基因F3′H和F3′5′H的表达。结果表明:转色至采收,共检测出花色苷花翠素类7种、花青素类5种、花葵素类1种。F3′H花后1周为上调表达,至转色为下调表达,转色后至采收为上调表达;F3′5′H自花后至转色为下调表达,转色后至采收为上调表达。     

不同叶色茶树品种(系)花青素合成相关基因的表达水平

采用实时荧光定量PCR技术检测不同叶色茶树嫩梢中花青素合成相关基因的表达水平,并比较各基因表达水平的差异.结果表明,桂皮酸-4-羟化酶(C4H)、类黄酮-3′-羟化酶(F3′H)和花青素合成酶(ANS)等结构基因在紫化茶树品种(系)的相对表达量显著高于白化茶树和常规绿叶茶树.紫化茶树因富含花青素呈紫红色,因此可推测C4H、F3′H和ANS等基因可能正向调控茶树花青素的合成与积累.     

比较转录组分析揭示花生种皮花青素积累的分子调控机制

花青素作为一种抗氧化物质,具有多种保健功效。与其他颜色花生相比,黑种皮花生具有良好的感官品质,且花青素含量更高。为了揭示花生黑种皮花青素形成和调控的分子机理,本研究以黑种皮花生(YH29)和粉红种皮花生(WH10)为研究对象,通过RNA-seq技术比较其转录组的差异。结果表明,与粉红种皮花生相比,黑种皮花生中1 539个基因表达上调,1 275个基因表达下调。KEGG分析发现花青素生物合成、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等多个与色素积累相关的通路在黑色种皮花生中富集。在黑种皮花生中,苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶等5个与花青素合成相关的关键酶基因表达上调,而与花青素生物合成途径竞争同一底物的一些关键酶基因,如柚皮素和甘草素基因,则表达下调,这使得有更多的底物流向花青素合成途径,这些基因的协同表达可能是黑种皮花青素高水平积累的关键。另外,两个R2R3-MYB转录因子在黑种皮花生中也表达上调,可能是引起花青素合成关键基因表达差异的关键因素。我们的研究结果为深入研究花生种皮花青素合成的分子机理及培育高花青素含量的花生新品种提供了参考。     

山药花青素合成关键酶基因的解析

测定了紫山药和白山药叶、茎、块茎中的花青素含量、积累量和积累速率,以及花青素合成酶基因PAL、F3H、DFR、ANS和UFGT的实时表达。结果表明:除了DFR基因外其他基因在山药幼嫩组织中的表达水平更高;所有基因在紫山药块茎中的表达水平较高;ANS和UFGT在紫山药中高度表达,而在白山药中低表达或不表达;块茎中花青素的动态积累量呈一个典型的双"S"曲线;PAL和F3H基因只在花青素积累速率最快之前的块茎膨大初期高度表达,而DFR、ANS和UFGT表达水平的两个高峰期与花青素积累速率的两个高峰期符合。推测控制紫山药颜色的关键酶基因可能是ANS和UFGT或两者之一。     

红苞凤梨AbF3′5′H基因上游调控因子筛选

颜色是观赏植物最重要的性状之一，也是当前观赏园艺育种的一个重要方向。为研究红苞凤梨红蓝色彩的呈现机制，初步分析金边红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)不同组织中花青素种类与含量，用AbF3′5′H基因启动子构建诱饵载体，利用酵母单杂交(Y1H)文库筛选其上游调控转录因子；并采用酵母单杂交验证技术，验证筛选出的转录因子与AbF3′5′H启动子的互作关系。结果表明：花青素的种类组成和相对比例决定了组织的颜色性状，AbF3′5′H是花青素合成途径种类分支的关键基因，在花青素种类组成与相对比例调控中具有重要作用；AbBTB/POZ、AbHSP81-1和AbGLOX能够与AbF3′5′H的启动子结合而调控其转录，可能在红苞凤梨花青素合成代谢调控中发挥重要作用。研究结果对于进一步揭示红苞凤梨花青素合成代谢调控机理，研究红苞凤梨呈色机理，培育叶色新品种有着重要的理论和实践意义。     

黄烷酮3-羟化酶基因表达分析及转基因大豆新种质创制

黄烷酮3-羟化酶(F3H)是大豆异黄酮代谢途径重要酶类。研究F3H在不同大豆品种中的表达差异,并应用转基因途径创制新种质是提高大豆异黄酮含量的重要途径。以高异黄酮含量大豆品种中豆27和低异黄酮含量大豆品种楚秀为试材,采用q PCR技术,分析F3H在大豆不同发育时期、组织部位中的表达差异;并利用花粉管通道转化技术,获得转F3H阳性植株。结果表明:F3H在2个大豆品种R1~R7期叶片中的表达模式不同,中豆27的F3H表达量在R1期最高,而后开始下降,R2~R5期维持较低水平,R6期略有上升,R7期又出现下降;楚秀F3H表达量在R1~R4期较低,R5期出现表达高峰,R6期开始下降。F3H在2个大豆品种R5~R8期籽粒中的表达模式基本相同,表达量均从R5期开始下降,且R6~R8期维持较低水平。基于此,构建F3H RNAi反义载体,并利用花粉管通道技术转入不同大豆品种,获得了5个转基因新材料。     

黑大豆种质抗氧化能力及其与总酚和花色苷含量的关系

【目的】分析127份黑大豆种质的总抗氧化能力及与其总酚和花色苷含量之间的差异和相关性。【方法】各类型之间差异采用平均数的t测验，聚类分析采用快速聚类法，相关性分析采用相关系数法。【结果】127份黑大豆种质种皮的总抗氧化能力、总酚和花色苷含量的变幅分别为0.44～3.56 mmol·g-1、7.05～74.82 mg·g-1和0.22～1.87 mg·g-1，表现出明显的基因型差异，不同类型及不同生态区黑大豆种质的总抗氧化能力、总酚和花色苷含量差异较大，其中，黑大豆/黄大豆、黑大豆春播/秋播、夏播/秋播、东北春/南方春、东北春/南方夏、北方春/南方春、北方春/南方夏之间的差异分别达极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）水平，总体趋势是北方春最高，东北春次之，南方春最弱。127份黑大豆种质可聚成6大类群，分别由3、24、20、31、37和12份种质组成。黑大豆的总抗氧化能力与其中的总酚和花色苷含量之间呈现极显著（P<0.01）正相关性。【结论】黑大豆的抗氧化作用与其种皮中所含的多酚和花色苷类物质关系密切。     

Correlation Between Antioxidation and the Content of Total Phenolics and Anthocyanin in Black Soybean Accessions

The objective of this study was to investigate the correlations between antioxidations and the contents of the total phenolics and anthocyanin in 127 accessions of black soybean. A T-test, a fast clustering procedure, and a correlation coefficient analysis were used for experimentation. The variation ranges of the total antioxidant capacity （TAC）, the total phenolics, and anthocyanin contents in 127 black soybean accessions were 0.44-3.56, 7.05-74.82, and 0.22-1.87 mg g-l, respectively, displaying significant genotype differences. The major differences in TAC, the total phenolics, and the anthocyanin contents existed among various types of accessions from geographical regions. The differences between the accessions from black and yellow soybeans, spring and autumn, summer and autumn, Dongbeichun and Nanfangchun, Dongbeichun and Nanfangxia, Beifangchun and Nanfangchun, and Beifangchun and Nanfangxia were significant at 0.01 or 0.05 levels, respectively. The general tendency was that the TAC, the total phenolics, and the anthocyanin contents of Beifangchun accessions were higher than that of Dongbeichun ones, while that of Nanfangchun accessions were the worst. 127 black soybean accessions could be clustered into 6 clusters, which consisted of 3, 24, 20, 31, 37, and 12 accessions, respectively. The most significant （P 〈 0.01） correlations existed respectively between the TAC and the total showed that the total substances phenolics content, and the TAC and the anthocyanin content of black soybean. The results phenolics and anthocyanin in black soybean seed coat were the important antioxidation     

农副产品粗提取物的抑菌作用研究

采用抑制菌丝生长速率法将棉籽饼、大豆饼、花生饼的粗提取物分别对黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、小麦赤霉病菌进行抑菌试验。结果表明 ,棉籽饼粗提取物供试最高浓度对黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌 6种病原菌的抑制作用明显 ;豆饼粗提取物供试最高浓度对黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌 5种病原菌抑制作用明显 ;花生饼粗提取物供试最高浓度对黄瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、苹果炭疽病菌 3种病原菌抑制作用明显 ,尤以棉籽饼、豆粕粗提取物的抑菌作用最佳 ,稳定性较好     

不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析

 【目的】了解不同黑大豆种质资源种皮中花色苷的组成、含量及其抗氧化能力分布情况。【方法】采用酸性甲醇浸提60个黑大豆种质种皮中的花色苷,通过与标准品对照,用HPLC法分析其种皮花色苷的组成及含量,同时用pH示差法测定各种质的总花色苷含量,采用氧自由基清除能力(ORAC)法测定各种质种皮的抗氧化活性。【结果】从60个黑大豆种质中共检测到飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷６种花色苷组分。其中有44个品种中检测到上述全部6种花色苷组分,而其余16个品种只含有其中的4－5种。矢车菊素-3-葡萄糖苷是所有受试黑大豆种质中含量最高的花色苷组分。不同黑大豆种质间各单体花色苷和总花色苷含量及其ORAC值抗氧化能力差异均较大,其中总花色苷含量的变幅为98.8—2 132.5 mg/100g,ORAC值的变幅为212.5—1 834.6 μmol TE/g,且各种质总花色苷含量与其ORAC值呈显著正相关关系(r = 0.62, P＜0.001)。采用快速聚类法将60个黑大豆种质聚成营养和花色苷活性成分含量差异显著的三大类群。【结论】不同黑大豆种质种皮花色苷组成基本相同,但其各花色苷单体及总花色苷含量存在显著差异,花色苷是黑大豆种皮抗氧化作用的重要物质基础。     

RNAi干扰的F3H基因转化大豆的研究

利用根据RNAi技术构建的干扰黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)的载体pF3Hi330,通过农杆菌介导辅助抽真空的大豆茎尖转化法和花粉管通道法将pF3Hi330载体整合到大豆基因组中,获得转基因阳性植株4棵,抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到大豆基因组中。同时,对转基因阳性植株异黄酮含量进行测定,显示异黄酮含量得到一定的提高。结果表明更多的前体流向异黄酮合成的分支途径,达到提高大豆异黄酮含量的目的。     

中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定

【目的】在江西婺源县孢囊线虫调查中,从大豆根及根际土壤中采集到一个孢囊线虫群体,其形态特征和分子特征与大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)存在较大差异,因此对其形态学和分子特征以及寄生性等进行详细研究,以明确其种类及对豆科作物寄生性,为病害防控提供科学依据。【方法】从婺源县采集的大豆根及根际土样,用筛淘法分离孢囊,大豆根系上的孢囊用直接解剖法获取。用浅盘法分离根际土样中的2龄幼虫和雄虫。选取具典型特征的饱满孢囊制作阴门锥切片,浅盘法分离的2龄幼虫和雄虫制作永久玻片,在显微镜下观察记录孢囊、2龄幼虫和雄虫的形态特征,并进行形态特征测量。采用两对植物线虫通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分别扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和28S大亚基D2-D3区段,经序列测定,用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining(NJ)method)构建该线虫群体与孢囊线虫属其他种群的ITS和LUS D2-D3系统进化树,分析其系统发育关系。在温室内采用盆栽人工接种的方法,测定江西孢囊线虫群体对11种豆科作物的寄生性,同时测定国内40个大豆栽培品种对该孢囊线虫的抗病性。【结果】形态学观察和特征值测量结果表明,从江西婺源大豆上采集的孢囊线虫群体,其孢囊形态、2龄幼虫以及雄虫的形态特征与野生豆孢囊线虫(Heterodera sojae)的形态特征基本一致;ITS序列(MG859982)比对发现其与野生豆孢囊线虫ITS序列(KU160510和KU160512)的同源性为99%和98%,而与大豆孢囊线虫ITS的同源性仅为81%(KY794762.1)。D2-D3序列(MG859981)与野生豆孢囊线虫(KU160511)相似度最高,为99%。序列系统进化树分析发现以ITS序列与D2-D3序列构建系统发育树的结果相一致,江西孢囊线虫群体与野生豆孢囊线虫分布在同一支,节点支持率为100%,而与大豆孢囊线虫聚在另一个分支中。结合形态学和分子生物学结果,将江西婺源大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种。寄生性研究结果表明,在参鉴的11种豆科作物中,野生豆孢囊线虫的2龄幼虫能在大豆和相思豆(红豆)上侵染和繁殖,完成生活史;虽然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8种作物根系,但不能完成生活史。测定的40个大豆栽培品种中,19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。【结论】在我国江西婺源新发现的一种寄生于大豆的孢囊线虫为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种;人工接种条件下相思豆(红豆)也是野生豆孢囊线虫的寄主,40个大豆栽培品种中30个对该孢囊线虫表现感病。     

基于指纹图谱技术快速检测掺伪花生油的方法探究

[目的]利用指纹图谱技术快速检测掺伪大豆油的花生油。[方法]利用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)建立大豆油、花生油、掺有大豆油的花生油GC-MS指纹图谱,并分别匹配特征峰,通过特征峰比对,快速辨识花生油与掺伪大豆油的花生油。[结果]花生油指纹图谱匹配了9个共有峰,掺伪花生油指纹图谱共匹配了10个共有峰,利用共有峰差异可快速筛选掺伪花生油。经过质谱数据库分析,掺伪花生油中增加的色谱峰为C18∶3不饱和脂肪酸,大豆油掺伪量最低检出限为5.5%(V/V)。[结论]利用指纹图谱技术可快速、准确地鉴别掺伪大豆油的花生油,也为其他油脂掺伪快速检测提供参考。