桑属IIS、trnL-F、rps16序列与进化分析

[目的]分析桑属ITS、trnL-F、rps16序列,探讨系统学价值.[方法]67份桑资源,经DNA提取、PCR扩增、测序,测序结果用软件拼接、比对,并从GenBank下载桑属ITS、trnL-F、rps16序列进行同源性分析,计算其长度、G+C(或A+T)含量、变异位点、信息位点,将3个序列合并,以构树、柘树为外类群,采用MP法分析进化关系.[结果]桑ITS(包括5.8S)基本序列长度为576 bp,变异范围为576-590 bp,G+C含量为59.55%--62.25%,40个信息位点;trnL-F(包括tRNA-Leu内含子)基本序列长度为923 bp,变异范围为920-924 bp,A+T含量为65.87%-66.31%,23个信息位点;rps16内含子基本序列长度为929 bp,变异范围为923-929 bp,A+T含量为67.28%-67.49%,17个信息位点.3个序列的最适碱基进化模型分别为(GTR+G)、(GTR)和(GTR+G),可能的分支概率-混合卡方概率值分别为0.000001、0.027175和0.000222,3个片段合并最适碱基进化模型为(GTR+G),基于模型用MP法分析,在2 538个位点中,有80个信息位点.分支图结果表明,首先将黑桑(M.nigra)分出,其它桑种分成2支,第一支包括长穗桑、瑞穗桑、蒙桑、鬼桑、鸡桑、山桑、白桑和广东桑,第二支包括华桑、奶桑和川桑.[结论]桑属traL-F和rps16序列信,息位点有限,单独研究桑属系统学,价值不大,与ITS序列合并研究,则能增加分支图的信息位点,使分支图更近于似然.基于ITS、trnL-F、rps16序列MP分支图,新疆黑桑为最原始类型,乌克兰等栽培种为进化类型.     

桑属ITS,TrnL-F,rps16序列分析及12个特殊桑资源评鉴

 【目的】分析桑属ITS,TrnL-F,rps16序列，探讨系统学价值，建立系统进化树，并对12个特殊桑资源进行评鉴，为开发利用提供理论依据。【方法】用67份桑资源，经DNA提取、PCR扩增、测序，测序结果用软件拼接、比对、除去非序列碱基，计算长度、G+C%含量、变异位点、信息位点、以构树、柘树为外类群，MP分析，根据分析结果，结合桑资源研究积累，对12个特殊桑资源进行评鉴。【结果】桑ITS(包括5.8S)基本序列576 bp ,变异范围576-590 bp，G+C% 59.55-62.25，40个信息位点；TrnL-F（包括tRNA-Leu内含子）基本序列923 bp , 变异范围920-924 bp, G+C%33.69-34.13，23个信息位点；rps16内含子基本序列929 bp ，变异范围923-929 bp，G+C%32.51-32.72，17个信息位点。最适碱基进化模型分别为(GTR+G),(GTR),(GTR+G),可能的分支概率，混合卡方概率值分别为0.000001 ,0.027175,0.000222, 三片段合并最适进化模型(GTR+G)，基于模型，MP分析， 2538个位点，80个信息位点。分支图首先将黑桑M. nigra分出，其它桑种分成两支，第一支桑(mulberry)，包括长穗桑、瑞穗桑、蒙桑、鬼桑、鸡桑、山桑、白桑、广东桑，第二支乔木桑(arbor)，包括华桑、奶桑、川桑。12个特殊桑资源，神农华桑♀（优质木材桑）分在第二支，乔木特性，其它11个特殊桑资源分在第一支，具桑(mulberry)特性。【结论】桑属TrnL-F;rps16序列信息位点有限，单独研究桑属系统学，价值不大，与ITS序列合并，能增加分支图的信息位点，使分支图更具客观性，更近于似然。基于ITS,TrnL-F;rps16序列MP分支图，新疆黑桑为最原始类型，乌克兰等栽培种是进化类型。桑属可根据分支的亲缘关系，结合桑资源研究积累，评鉴特殊桑资源。     

苞叶姜的nrDNA ITS2和cpDNA psbB-H序列 分子进化特点的分析

采用改良的CTAB法从硅胶干燥的苞叶姜(Pyrgophyllum yunnanense)叶片中提取总DNA,对nr DNA ITS2和cp DNA psb B-H区域进行PCR扩增、测序和序列分析,初步研究2套植物基因组的变异速率。nr DNA ITS2序列长224 bp,有变异位点3处,变异位点百分率为1.339%,(G+C)含量为60.7%。cp DNA psb B-H序列长623~625 bp,有2个碱基插入缺失,变异位点8处,变异位点百分率1.284%,(G+C)含量为33.9%,cp DNA核苷酸多态性(0.00551)比nr DNA(0.00295)高。苞叶姜的这2个片段,变异速率相近,遗传分化指数相同(Fst=1.000),居群间高度分化。ITS2序列和psb B-H序列单倍型中性检验结果一致,表明苞叶姜居群处于长期稳定状态。psb B-H错配分布(Mismatch-distribution)分析,表示苞叶姜的现有分布范围近期可能经历了居群扩张。因此,苞叶姜的谱系地理学研究可结合nr DNA ITS2序列和cp DNA psb B-H序列来分析。     

不同种源辽东冷杉rDNA ITS序列及其亲缘关系

对6个种源辽东冷杉的r DNA ITS序列进行了扩增、纯化和测序,比较分析了各种源r DNA ITS序列的长度、碱基变异位点、(G+C)含量和遗传距离,构建了系统发生树。结果表明:辽东冷杉6个种源的r DNA ITS序列总长度均为1 355 bp,其中ITS1、ITS2和5.8S r DNA序列长度分别为1 162、71和162 bp,种源间无长度差异;r DNA ITS序列中只有8个碱基变异位点,均位于ITS1序列上,碱基变异类型为碱基转换或颠换;ITS1和ITS2序列中的(G+C)含量分别为60.24%~60.59%和58.60%,种源间(G+C)含量差异极小;种源间遗传距离平均值仅为0.002 3,其中清原种源和宽甸种源的遗传距离最小(0),其他种源间的遗传距离在0.000 7~0.003 7。上述结果均表明辽东冷杉种源间亲缘关系较近,遗传变异程度较低。系统发生树将地理距离相近的种源聚在一起,表明辽东冷杉6个种源遗传距离与地理距离有明显的相关性。     

基于nrDNA ITS对23种兜兰属植物的分子系统学分析

采用PCR直接测序法,测定23种兜兰属植物的内部转录间隔区(ITS)序列,并结合GenBank中所查到的德氏兜兰(AJ564372)、波瓣兜兰(AY530916)及麻栗坡兜兰(AJ564357)的核糖体DNA(nrDNA)ITS区序列进行比对,确定23种兜兰的ITS1、5.8S及ITS2的界限。结果表明:23种兜兰植物的nrDNA ITS序列长度为717～787 bp;G+C含量为48.6%～51.5%,其中ITS1和ITS2长度分别为393～451 bp及155～180 bp,包括211个变异位点;109个信息位点。基于贝叶斯法和最大简约法构建系统聚类树,结果表明,2种方法构建的树基本一致,整个树分为2个分支3个亚组,表明基于nrDNA ITS序列能够鉴定分析兜兰属植物种间的亲缘关系。     

基于DNA条形码的我国吴茱萸主要栽培种遗传分析和分子鉴别研究

采用ITS2和psbA-trnH DNA条形码组合分析我国吴茱萸主要栽培种的遗传背景,并对其进行分子鉴别。获得的ITS2序列全长223 bp,共获得7个差异位点,其中特异性鉴别位点2个;psbA-trnH序列全长419 bp,获得特异性鉴别位点3个。基于ITS2碱基序列采用邻接法构建系统聚类树,结果表明:吴茱萸、石虎和疏毛吴茱萸的遗传背景差异较为明显,且吴茱萸与石虎的亲缘关系更为接近;嫁接可以使吴茱萸的遗传背景发生较大的变异;并且序列特异性位点可以准确有效地对吴茱萸正品和伪品进行鉴别。     

传统中药材麦冬的DNA条形码鉴定

该文分析了DNA条形码序列(ITS、psb A-trnH、matK、rbcL和trn L-F)对采自10个不同产区的麦冬进行PCR扩增及测序。结果表明,ITS序列变异位点为11 bp且较稳定。叶绿体序列的变异位点较低。本研究构建了ITS及联合叶绿体片段与ITS的系统发育树,4个叶绿体片段各自构建的系统发育树结果不理想,以ITS构建的系统发育树为主。广西桂林、贵州贵定与浙江余杭聚为一支;四川什都、四川珙县与广东肇庆聚为一支;云南麻栗坡与云南石林聚为一支;江西庐山与湖南桑植聚为另一分支,位于发育树基部;以上分支均得到G+C含量和遗传距离的支持,种内具有较近的亲缘关系。ITS序列具有稳定的变异位点和鉴定位点,能够准确的鉴定不同产地的麦冬,基于ITS构建的系统发育树能够较好的区分其亲缘关系。     

基于ITS和trnl-trnF序列的新疆扁桃种质资源亲缘关系研究

为探究新疆扁桃种质的亲缘关系,以新疆‘纸皮’与‘阿曼尼沙’等24个扁桃种质为材料,对其叶片及果实的植物学性状进行对比分析。提取总DNA后分别对ITS与trnl-trnF序列进行PCR扩增、纯化及测序,将所测序列进行拼接及同源性比对。利用MEGA5软件构建基于ITS和trnl-trnF序列的不同扁桃种质间的系统发育树。通过植物学性状对比发现,‘矮丰’的叶形指数最高为4.12,‘叶尔羌’的出仁率为72.9%,在供试24个扁桃种质中最高。经相关生物信息学软件分析表明,ITS序列长度为608~610bp,包括42个变异位点和9个简约信息位点,G+C含量为61.16%~61.90%。trnl-trnF序列长度为915~933bp,其变异位点和简约信息位点丰富,分别为457个和332个,分别占总长的48.8%和35.7%,G+C含量较低,为32.46%~32.94%。基于ITS和trnl-trnF序列的系统发育树表明,ITS序列间的遗传距离为0.000~0.008,trnl-trnF序列间的遗传距离为0.000~0.400,‘双薄’与‘双软’具有相同的遗传背景。     

仿刺参3个地理群体ITS1序列变异及系统发生分析

利用核糖体DNA第一内转录间隔区(Internal transcribed spacer 1, ITS1)序列,对中国大连(CD)、朝鲜罗津( KN)和俄罗斯海参崴( RV)仿刺参Apostichopus japonicus 3个群体的遗传结构进行分析。结果表明：经PCR扩增、克隆测序,获得长度为517~519 bp、524 bp两种类型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5%)显著高于A+T含量(35.5%);在仿刺参30个个体61条序列中共检测到49个变异位点,多态位点比例为9.33%,其中有4个简约信息位点,共有40种基因型,群体共享基因型为2个;遗传多样性分析表明,3个群体的遗传多样性丰富;分子方差分析显示,88.65%的变异来自于群体内部,群体间遗传分化较弱或中度分化;根据群体间遗传距离进行的聚类分析发现, KN群体与RV群体的亲缘关系较近, CD群体与KN、 RV群体的亲缘关系较远。     

药用石斛rDNA ITS序列分析

为准确进行药用石斛资源鉴定,阐明属内的种间关系,以32个药用石斛样品基因组DNA为模板,采用rDNA ITSPCR扩增、测序、分子遗传进化分析等方法,研究了供试药用石斛间的遗传多样性.结果表明:32个石斛样品的ITS序列(只包含ITS1、5.8S rDNA ITS和ITS2)长度变化范围在632～645 bp之间,ITS1长度为225～234 bp,GC含量为43.8％～53.1％,变异位点198个、占总位点81.48％,简约信息位点138个、占总位点56.79％;ITS2长度为240～247 bp,GC量为47.0％～55.9％,变异位点183个、占总位点72.90％,简约信息位点123个、占总位点49.00％.建立了28种药用石斛(共32份)rDNA ITS区碱基全序列数据库,为石斛的分子鉴定提供了依据.     

向海桑1号遗传背景的AFLP分析

本文利用AFLP(Amp lified Fragm ent Length Polymorph ism)分子标记技术,即扩增片段长度多态性,从DNA分子水平对蒙桑(M orusm ongolica)、白桑(M orus alba)、鲁桑(M orusmulticaulis)等5个包括向海桑1号在内的桑树品种或类型进行了遗传背景分析,构建了其指纹图谱。通过分析表明,向海桑1号与参试的两个蒙桑类型以及1个白桑和鲁桑栽培品种遗传相似系数都低于0.8271,其中向海桑1号与向海桑30号间的遗传相似系数仅为0.5566,遗传关系较远。本研究从基因组DNA分子水平上初步分析向海桑1号的遗传背景,为今后该品种作为育种材料提供了理论依据。     

桑树肌动蛋白MaACT3启动子的克隆及农杆菌介导的瞬时表达

【目的】克隆桑树肌动蛋白MaACT3的启动子。【方法】采用抑制PCR技术获得肌动蛋白的5′端侧翼序列;采用农杆菌感染成熟叶片瞬时表达检测启动子活性。【结果】获得的5′端侧翼序列含有基因的翻译起始位点、第一外显子、第一内含子和第二外显子的一部分,外显子部分与已报道的桑树肌动蛋白MaACT3序列完全相同。通过荧光显微镜观察到了绿色荧光,在mRNA水平上也检测到表达,证实了获得的5′端序列具有启动活性。【结论】获得的桑树肌动蛋白MaACT3的启动子具有启动活性,可以应用于桑树转基因研究。     

桑树多倍体鉴定和育种研究现状

近年来发现桑属植物存在14条染色体的2倍体(2n=2x=14)物种,而过去认为桑树2倍体有28条染色体(2n=2x=28),这些研究引起对桑属植物染色体组基数的关注。本文概述在植物多倍体研究中细胞学和分子技术的最新进展和应用;总结桑树多倍体类型、形成原因、表型效应及其生产应用;介绍桑树4倍体、3倍体的人工诱变创制技术,包括诱变处理方法、诱变后的管理、诱变体的选择、3倍体的人工有性杂交培育等,以及桑树多倍体的鉴定方法。指出采用物理和化学方法诱导与杂交育种技术结合是桑树多倍体育种的关键技术。提出多倍体育种今后研究的主要方向,为桑树多倍体育种和应用研究提供理论参考。     

桑树硝酸还原酶基因MaNR的克隆及其表达分析

【目的】以桑树栽培品种桂优62号为材料,克隆桑树硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）基因全长cDNA和DNA序列并分析其序列特征,在此基础上研究桑树硝酸还原酶基因在桑树细胞脱分化和分化过程中的表达特征以及影响因素,为进一步阐述硝酸还原酶在桑树生长发育中的作用机制奠定基础。【方法】基于单倍体川桑（Morus notabilis Schneid）基因组数据（http://morus.swu.edu.cn/morusdb）注释的scaffold570序列设计特异引物,硝酸钾处理桑树叶片48 h后使用RNAiso Plus（TaKaRa）和改良CTAB法提取总RNA及基因组DNA,分别以cDNA和DNA为模板,用RT-PCR法克隆获得桑树NR全长cDNA和DNA序列,运用生物信息学手段对推定的氨基酸序列进行分析。以桑胚轴为外植体,在无菌条件下,接种在不同氮源、生长调节物质的培养基中,通过桑树胚轴离体再生过程和real-time PCR方法研究硝酸还原酶基因在离体再生过程中的表达差异以及不同氮源、生长调节物质对NR表达的影响。【结果】克隆获得的桑树NR全长CDS序列,长2 730 bp,编码909个氨基酸,推导的蛋白质分子量为102.84 kD,等电点为6.76。基因组序列长5 142 bp,包含5个外显子和4个内含子,具有完整的5个结构域。通过氨基酸序列比对发现,其序列高度保守,与川桑NR序列同源性达95%,与蔷薇科果树NR序列同源性达78%。聚类分析表明,单子叶植物聚为一组,桑树与蔷薇科果树聚为一组。GenBank登录号分别为KF992020.1和KF992021.1。NR在桑根中表达量最高,叶中表达次之,茎中表达最少;谷氨酸显著提高NR在桑叶中的表达量,GA3显著提高NR在桑茎中的表达量。桑胚轴在单一的NH4+-N培养基中,不能被诱导出愈伤组织及丛生芽,在单一的NO3--N培养基中可以诱导出愈伤组织和丛生芽;但丛生芽继代培养在单一NH4+-N的培养基中和单一的NO3--N培养基中都可以生长。real-time PCR结果显示,NR在子叶和胚轴中的表达量高于胚根。桑胚轴在离体诱导愈伤组织和丛生芽分化过程中,NR的表达量逐渐增加,丛生芽形成后NR的表达量降低并趋于稳定。NH4+-N和NO3-N对NR在继代丛生芽中没有显著影响,谷氨酸对NR在继代丛生芽中有抑制作用,随着培养时间延长,丛生芽的NR相对表达量都降低。【结论】获得了桑树NR全长cDNA序列。硝态氮是桑胚轴诱导的必需营养因子,NR的表达受到桑树细胞脱分化和分化影响。     

山东17个桑品种叶片中1-脱氧野尻霉素含量的测定

为了选择适合山东地区的药用及保健功能桑树品种,选取山东省内有代表性的桑品种17个,采用反相高效液相色谱法测定桑叶的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量。结果表明:桑属不同种间1-DNJ含量存在显著性差异,白桑最高;不同桑品种间的1-DNJ含量差别显著,晋选6号和秋雨分别是鲁桑和白桑中含量最高的品种,达0.2777%和0.3281%,适合直接作为桑叶1-DNJ开发的专用桑品种或育种材料。     

15个果桑无性系指纹图谱的构建

用改良的CTAB法提取15份果桑无性系的基因组DNA,通过RAPD分子标记技术,构建不同果桑无性系的指纹图谱。结果表明:每条引物扩增出8～15条清晰地条带,其中多态性条带数为4～15条,多态性比例为50.0%～100.0%。20条随机引物共得到232条清晰的条带,多态性条带为178条,平均多态性比例为76.7%;利用随机引物OPA-09和OPD-05的扩增产物电泳图为基础构建的指纹图谱可以鉴定出15个果桑无性系。     

桑树脱落酸生物合成相关基因的鉴定及转录表达分析

【目的】9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）、醛氧化酶（AAO）和玉米黄质环氧化酶（ZEP）在脱落酸（abscisic acid,ABA）间接途径合成中发挥主要调节作用,它们是ABA合成相关基因。以桑树栽培品种嘉陵40号（Morus atropurpurea Roxb.）果实为材料,测定其发育过程中ABA的含量,分析桑椹成熟过程中ABA合成相关基因的转录表达、ABA及其合成抑制剂对果实发育的影响,为研究ABA在桑椹成熟和衰老过程中的作用机制提供基础数据。【方法】根据从单倍体川桑（Morus notabilis Schneid.）基因组数据库（http://morus.swu. edu.cn/morusdb）下载的ABA合成相关基因序列,对其DNA及推导的氨基酸序列进行分析。使用RNAiso Plus（TaKaRa）提取总RNA。以cDNA为模板,利用real-time PCR方法检测不同时期和不同处理桑椹中ABA合成相关基因的转录表达差异。利用高效液相色谱法,测定桑椹发育过程中的ABA含量。【结果】在川桑基因组数据库筛选鉴定到6个ABA合成相关基因：1个MnAAO、2个MnZEP和3个MnNCED。MnNCED1-3氨基酸序列高度保守,聚类分析表明它们与双子叶果树NCEDs序列同源性较高,与单子叶植物同源性较低;转录分析表明它们在叶中转录水平相对高于其他组织,在根中最低。其中MnNCED2和MnNCED3在根、皮、冬芽、雄花、叶中的转录水平较高。随着果实的发育,ABA含量在转色期开始逐渐上升。外源ABA处理后,桑椹脱落率升高,而氟啶酮（fluridone）可以抑制桑椹的脱落。MnNCED1-3在果实发育中后期的转录水平较高,与ABA含量的升高相一致,而MnAAO和MnZEP1-2在中后期下调。离体桑椹经ABA处理后,MnNCED1、MnAAO和MnZEP1的转录水平直到第4天才出现上调,MnNCED3在第3天和第4天被上调,MnZEP2一直上调;氟啶酮处理后MnNCED1和MnZEP2的转录表达量只在第1天和第3天被下调,MnAAO和MnZEP1只在第4天升高,MnZEP1只在处理后第1天被下调,MnNCED2在ABA和氟啶酮处理后均被下调。【结论】从桑树中获得了6个ABA合成相关基因MnAAO、MnZEP1-MnZEP2和NCED1-NcED3,MnNCEDs在果实发育中后期的转录表达相对较高,并与ABA的含量变化相一致,可能对ABA的合成起主要调控作用,外源ABA处理能够促进桑椹的成熟和脱落,氟啶酮处理能够抑制桑椹的成熟和脱落。     

三种桑生理特性对盐胁迫的响应

以龙桑（Morus alba cv. Tortuosa）、鸡桑（Morus australis Poir. var. Australis）、蒙桑（Morus mongolica Schneid.）为研究对象，探究了不同浓度盐胁迫（0、100、200、300、400 mmol·L-1）对3种桑的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、叶绿素、可溶性糖（soluble sugar，SS)、过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide，SOD）等生理指标的影响。结果表明：在盐胁迫过程中，3种桑科植物中MDA含量随盐浓度的升高而增加,蒙桑MDA含量均高于其他桑品种；叶绿素含量随盐浓度的升高逐渐下降，在盐浓度为400 mmol·L-1时，龙桑、鸡桑、蒙桑叶绿素含量达到最小值，分别为6.75、12.61、8.93 mg·g-1；随着盐浓度的升高，SOD活性、POD活性、SS含量均呈现先增加后降低的趋势。研究结果可为西部盐渍化地区栽植不同桑品种的耐盐性能评价提供理论依据。     

湖北省桑属植物亲缘关系RAPD分析

[目的]采用RAPD和ITS方法分析湖北省桑属植物亲缘关系。[方法]利用RAPD分析湖北省桑属植物的亲缘关系,并与ITS分支图进行比较,研究湖北省桑属植物亲缘关系。[结果]两者在分析桑属的亲缘关系时,均把桑属分为2大支。其中,RAPD多态性高,适合居群遗传多样性分析;但RAPD资料属等位基因频率资料,不同种的RAPD扩增产物往往并不同源,不宜假定外类群,无法确定树根。ITS为核糖体基因内转录间隔区的差异,位点的变异往往能反映出桑属种间的差异,宜假定外类群,进行分支分析。但ITS资料并不能把桑属所有桑种分开。[结论]在研究桑属的亲缘关系时,先用ITS进行粗略的分类后,再用RAPD进行细分的结果较准确。