白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104~105。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

抗犬细小病毒的单克隆抗体的制备

CPV YZ株的细胞培养液经蔗糖密度梯度离心纯化后作为免疫原免疫BALB/C小鼠 ,应用杂交瘤技术筛选出 8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,分别命名为F5G10、3F11F4、F11G6、6C5C2、6E4G3、6C2B11、F11D6、3D9C4株 ,各株单抗均为IgG型 ;中和试验表明 :F11G6、3D9C4、6E4G3、6C5B114株单抗有中和作用 ,Dot ELISA试验证明了 8株单抗仅针对病毒抗原决定簇的空间结构。     

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。     

抗犬细小病毒的单克隆抗体的制备

CPV－YZ株的细胞培养液经蔗糖密度梯度离心纯化后作为免疫原免疫BALB／C小鼠，应用杂交瘤技术筛选出8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为F5G10、3F11F4、F11G6、6C5C2、6E4G3、6C2B11、F11D6、3D9C4株，各株单抗均为IgG型；中和试验表明：F11G6、3D9C4、6E4G3、6C5B114株单抗有中和作用，Dot-ELISA试验证明了8株单抗仅针对病毒抗原决定簇的空间结构。     

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。     

6种功能性添加剂组合对克氏原螯虾生长和繁殖的影响

在饲料中拌喂高稳VC应激宝(A组)、免疫多糖(B组)、EM菌(C组)、高稳VC应激宝+EM菌(D组)、免疫多糖+EM菌(E组)、高效生物离子钙(F组),不喷涂任何功能性添加剂的颗粒饲料组作为对照组(G组),研究6种功能性添加剂组合对克氏原螯虾生长和繁殖的影响.结果表明,F组克氏原螯虾特定生长率最高(0.918％/d),G组次之,C组最低(0.552％/d);D组克氏原螯虾成活率最高(84.4％),A组次之,E组最低;G组克氏原螯虾抱卵率最高(81.6％),C组次之,F组最低.由此可见,在高温和克氏原螯虾繁殖季节,适量拌喂离子钙可以有效促进克氏原螯虾的生长;拌喂VC和EM菌可以提高克氏原螯虾的成活率;用于繁殖的克氏原螯虾不需要喂养任何功能性添加剂,就可以取得不错的繁殖效果.     

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E.coli O157:H7(EHEC-O157:H7)用甲醛灭活、超声破碎,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞;与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,获得7株分泌抗E.coli O157:H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2aκ、IgG2aκ、IgG1κ、IgMκ、IgMλ、IgMκ和IgG2aκ.用间接ELISA检测,E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×103,腹水效价均为1×1011;C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×102,腹水效价均为1×103.相加ELISA结果显示,F1、G9和G11 3株mAbs对应相同的抗原表位,而其它4株对应不同的抗原表位.用间接ELISA分析特异性,7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应.Western blotting表明,C3、E7和F1 3株mAbs在蛋白分子量28×103处有特异性条带,而其它4株mAbs则未显示蛋白带.     

猪肺炎支原体168株特异性单抗的制备及鉴定

将猪肺炎支原体168株全菌蛋白免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,3次亚克隆后,获得了4株针对168株全菌蛋白的单抗,分别将其命名为2F5、2G7、4F5、5E9。Western-blot检测结果表明,2G7、4F5与猪肺炎支原体具有特异性反应条带,不与猪鼻支原体、大肠杆菌反应。亚型鉴定结果表明,两株特异性单抗(2G7、4F5)的亚型属IgG1,轻链为κ型,2F5、5E9亚型属IgG2a,轻链为κ型。间接免疫荧光结果表明,4株单抗均与猪肺炎支原体168株有特异性荧光反应,特异性单抗的获得为猪肺炎支原体的检测及机理研究奠定基础。     

不同模式养殖红螯螯虾营养对比分析

对同一苗种来源、同样饵料投喂的红螯螯虾，分别采用池塘和稻虾综合种养2种模式进行养殖，对其肌肉营养成分进行了分析和评定。结果表明：池塘组红螯螯虾肌肉粗脂肪含量显著高于稻虾共作组，池塘养殖红螯螯虾异亮氨酸和组氨酸、精氨酸均显著高于稻虾共作组红螯螯虾，池塘组红螯螯虾肌肉中二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)均显著高于稻虾共作组，而二十碳五烯酸(EPA)含量显著低于稻虾共作组，总多不饱和脂肪酸(PUFA)含量显著高于稻虾共作组，2种养殖模式的红螯螯虾均含有丰富的不饱和脂肪酸。池塘组红螯螯虾肌肉中K、Zn和Fe的含量均显著高于稻虾共作组，Mg、Se和Cu矿物元素含量，池塘组红螯螯虾均显著低于稻虾共作组。2种模式养殖的红螯螯虾肌肉营养成分存在上述差异的原因，可能主要是由池塘养殖和稻虾共作环境差异造成的。     

克氏原螯虾与红螯螯虾血相的比较研究

对克氏原螯虾与红螯螯虾的血相进行了比较研究。结果表明 :克氏原螯虾与红螯螯虾的血细胞均由无颗粒细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞组成 ;其血细胞数量分别为 7.0 2× 10 6个 /ml和 1.6 5× 10 6个 /ml。 2种螯虾的血细胞大小与核质比均存在显著差异 ;无颗粒细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞占血细胞总量的百分比在克氏原螯虾为 10 .2 1%、74 .4 1%和 15 .4 8% ,在红螯螯虾为 13.72 %、6 8.84 %和 17.5 4 %。     

钩端螺旋体七日热血清型(56610)特异性单克隆抗体的研制

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４为特异性抗５６６１０杂交瘤．抑制试验结果表明，多抗血清能够有效地抑制这些特异性单抗，这些特异性单抗被鉴定为ＩｇＧ１亚类．     

金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的制备

为获得稳定性好、特异性强、效价较高的抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体,用热灭活的金黄色葡萄球菌wol-04菌体抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为筛选抗原进行克隆筛选,并对各株单抗的生物学特性进行分析和鉴定.结果表明:试验获得了3株稳定分泌SPA单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中单克隆抗体3B11、4F7为SPA表面抗原表位的单克隆抗体,与金黄色葡萄球菌wol-04菌体和SPA有较强的免疫反应性,免疫球蛋白亚类分别为IgG1和IgG3,具有稳定性好、特异性强、效价较高的特点.     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体制备及部分特性鉴定

以原核表达系统pGEX-6p-1-N/BL21经IPTG诱导表达的重组PEDV N-GST融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备单克隆抗体,用原核表达系统T12-pPROHTa/BL21经IPTG诱导表达的PEDV N蛋白做筛选抗原,通过间接ELISA进行筛选,获得两株抗PEDV N蛋白杂交瘤细胞,命名为2E3、4C6。亚类鉴定为IgG1和IgG2a型,均为к链抗体,染色体数平均为(91±7)对。用制备的单抗与pGEX-6p-1-N/BL21、T12-pPROHTa/BL21诱导表达后的菌体裂解物做Western Blot试验,在不同载体表达的N蛋白处出现明显的特异性条带;通过间接ELISA做病原检测,这两株单抗不与TGEV、PRV和PrV发生交叉反应,而与PEDV显示良好的特异性反应。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

分泌抗水稻细菌性条斑菌单克隆抗体杂交瘤株的建立及其在种子检验上的应用

本文首次报导了通过硫酸铵沉淀法提取水稻细菌性条斑菌(Xanthomonas campestris pv.oryzicola)(以下简称细条菌)的蛋白质,并以它作抗原建立了4个杂交瘤细胞株E_5、E_8、A_5和F_(11),其培养物上清的ELISA效价为1:20～1:160,腹水效价为1:10~6～1:10~7。该4个细胞株所分泌的单克隆抗体(McAb)与58个不同来源的细条菌都呈阳性反应,而对参试的具有一定代表性的其它13个细菌种,均呈阴性反应。试验还表明,4种McAb是针对同一抗原决定簇的,其亲和力大小为:E_8>A_5>E_5>F_(11)。应用McAb进行种子带菌检验也获得成功。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以提纯的IBV-M病毒抗原免疫BALB/C小鼠,末次免疫后三天取脾细胞与SP_2/O细胞在50％PEG2000作用下融合,三次融合两次获得成功。经抗体检测、筛选和克隆化培养,最后获得三株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。三株杂交癌细胞经体外连续传代培养2个多月,以及液氮冻存4个月后复苏培养,仍能稳定地分泌抗体。     

抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

用基因疫苗pcDNA-H9、纯化H9N2亚型AIV和重组噬菌体T4-H9HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6)、H9-02(3B1)、H9-03(3H11)、H9-04(1A4)、H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01、H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。为进一步分析H9N2亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。