基于密码子优化策略的牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的原核表达及纯化

为了构建pET30a-bPAG9重组表达载体,并在BL21(DE3)感受态细胞中转染高效表达牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9),通过生物信息学技术对bPAG9基因进行密码子优化,人工合成bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体pET30a中。将构建的重组质粒pET30a-bPAG9转染至BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,经过超声波裂解和亲和层析方法获得重组蛋白bPAG9。用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白bPAG9的表达效果。结果显示,PCR扩增得到1 128 bp的优化bPAG9基因片段,构建的重组质粒pET30a-bPAG9经双酶切获得约5 244 bp和1 125 bp的2条片段,与预期值相符;对重组载体测序,测序结果与优化后的基因碱基序列完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得相对分子质量约为4.0×10~4的bPAG9重组蛋白,通过亲和层析纯化后,重组蛋白bPAG9纯度到达90%以上。     

牛妊娠相关糖蛋白boPAG2双抗体夹心ELISA体系的建立

【目的】通过双抗体夹心ELISA体系实现对牛妊娠相关糖蛋白boPAG2的免疫学检测,为后续研发牛妊娠检测试剂盒奠定基础。【方法】将自制boPAG2作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,以细胞融合技术对呈阳性的杂交瘤细胞进行筛选。运用ELISA相加性试验筛选最佳配对抗体,初步建立起双抗体夹心酶联免疫吸附试验系统,采集牛场中120头荷斯坦奶牛血清样本进行初筛。【结果】筛选出3株能稳定分泌boPAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C01,5E02,3B05。纯化出单克隆抗体滴度为(1∶22.48×10⁴)～(1∶11.96×10⁴),免疫球蛋白亚型均为IgG。ELISA相加性试验筛选出2株可识别boPAG2抗原不同表位的最佳配对抗体5E02和3B05。当5E02作为包被抗体,3B05作为检测抗体时,其最佳稀释质量浓度为1.25μg/mL,检测boPAG2的灵敏度可达5μg/mL。【结论】制备和选定了两株最佳配对单克隆抗体5E02和3B05,该对抗体效价高,通过建立双抗体夹心ELISA体系实现对boPAG2的免疫学检测,并对少量血清样品进行了初步...     

牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化

【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM-bPAG9重组载体后转到DH5α感受态细胞中,重组质粒转染至哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达,再通过亲和层析纯化bPAG9重组蛋白(rbPAG9),经SDS-PAGE 和 Western Blot 检测rbPAG的表达效果。【结果】通过全基因合成法得到1 182 bp的bPAG9基因片段,构建的重组质粒proEM-bPAG9经双酶切获得约4 369 bp和1 176 bp的两条片段,与预期值相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE 和 Western Blot 鉴定显示,获得相对分子质量约为68 kDa 的bPAG9重组蛋白,通过Ni2+亲和层析纯化后,rbPAG9纯度可达90%。【结论】通过基因优化及真核表达获得分子质量为68 kDa 的rbPAG9重组蛋白。     

牛妊娠相关糖蛋白6基因密码子优化及其在HEK293细胞中的表达

[目的]解决天然牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)不易分离纯化的问题,获得高效异源表达且具有良好免疫反应性的bPAG6,为国产bPAG检测产品的研发提供技术支持.[方法]根据宿主细胞对密码子的偏好性,利用MaxCodonTM在不改变氨基酸序列的前提下,对bPAG6基因密码子进行优化,采用全基因合成技术扩增优化后的bPAG6基因,构建proEM-bPAG6重组载体,并转染至HEK293细胞中进行高效表达;然后通过SDS-PAGE电泳、Western blotting和ELISA检测重组蛋白的表达效果及免疫反应性,并利用在线生物信息学分析软件对重组蛋白的结构及功能进行预测.[结果]优化后bPAG6基因的密码子适用指数(CAI)由0.80提高到0.96,G+C含量由49.4%提高到58.8%,其蛋白编码区(CDS)长度为1137 bp,共编码379个氨基酸残基.将全基因合成技术扩增获得的bPAG6基因插入proEM载体构建proEM-bPAG6重组载体,经EcoR I和Hind III双酶切鉴定可获得2条与预期结果相符的片段[proEM载体(4369 bp)和bPAG6基因(1176 bp)],测序结果也显示其碱基序列与优化后的bPAG6基因完全一致.proEM-bPAG6重组载体转染HEK293细胞表达获得的重组蛋白bPAG6分子量约46 kD.重组蛋白bPAG6可被抗bPAG6抗体识别,即具有良好的免疫反应性.重组蛋白bPAG6信号肽由N端的前15个氨基酸残基组成;存在5个N-糖基化位点,其N-糖基化修饰主要位于57Asn、73Asn、102Asn、124Asn和181Asn位点处;重组蛋白bPAG6为分泌性蛋白,无跨膜螺旋区,其二级结构由无规则卷曲(42.74%)、延伸链(31.93%)、α-螺旋(19.26%)和β-转角(6.07%)组成.[结论]通过基因优化及真核表达获得的重组蛋白bPAG6具有良好免疫反应性,可作为抗原应用于牛早期妊娠快速诊断产品的研发.     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化鲤春病毒血症病毒(SVCV)G蛋白,制备特异性单克隆抗体,扩增出鲤春病毒0504分离株G基因片段,并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经诱导表达、裂解离心包涵体,包涵体经His Bind亲和层析柱纯化及尿素浓度梯度复性后,作为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果表明:成功筛选出2株稳定分泌G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C5、2D5,经Western-Blot检测表明,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。本研究中成功制备的抗G蛋白单克隆抗体,可为建立新型鲤春病毒检测方法提供工具。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化鲤春病毒血症病毒( SVCV) G蛋白,制备特异性单克隆抗体,扩增出鲤春病毒0504分离株G基因片段,并将其克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,经诱导表达、裂解离心包涵体,包涵体经His Bind亲和层析柱纯化及尿素浓度梯度复性后,作为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果表明：成功筛选出2株稳定分泌G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1 C5、2 D5,经Western-Blot检测表明,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。本研究中成功制备的抗G蛋白单克隆抗体,可为建立新型鲤春病毒检测方法提供工具。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型基因片段的原核表达及单克隆抗体的制备

根据Genebank上已报道的鸭肝炎病毒Ⅰ型基因的全长序列,设计了1对引物,通过RT-PCR方法扩增出特异的DHV-Ⅰ基因片段;将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌Rosetta-gami(DE3),并用IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,获得了表观分子量在20kD左右的融合表达蛋白;将表达纯化后的蛋白作为抗原,免疫BALB/c健康小鼠,筛选和制备了1株DHV-Ⅰ单克隆抗体细胞株。Western-blot及ELISA分析表明:表达的重组蛋白均能与鸭DHV-Ⅰ阳性血清和制备的DHV-Ⅰ单克隆抗体产生反应。同时,制备的DHV-Ⅰ单克隆抗体除了能与重组蛋白反应,还能识别天然的DHV-Ⅰ病毒蛋白。     

牛妊娠相关糖蛋白16(bPAG16)基因密码子优化及表达

[目的]对bPAG16基因进行优化和合成,构建proEM-bPAG16重组表达载体,将重组质粒转染至HEK293细胞中,获得bPAG16重组蛋白,为家畜早期妊娠诊断技术的研发提供技术支撑.[方法]通过生物学技术对bPAG16基因密码子进行优化和人工合成,经T4?DNA连接酶将bPAG16基因插入到proEM载体中,构建...     

鲤春病毒血症病毒核蛋白原核表达及单克隆抗体制备

以含有鲤春病毒血症病毒核蛋白基因的质粒N-RFP为模板,通过PCR方法扩增N基因编码区全长,大小为1 254bp。将该基因连接到pGEX-KG载体上,构建了SVCV-N-KG重组质粒。将重组质粒转化到BL21菌株中进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳分析鲤春病毒血症病毒N蛋白的表达情况。以纯化后的N蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,ELISA测定免疫小鼠的血清效价。将血清效价较高的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,4次亚克隆后,通过ELISA及染色体数目分析筛选出1株杂交瘤细胞,命名为N-2。将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔制备单克隆抗体。经间接免疫荧光和免疫印迹实验证明该抗体可以特异性识别鲤春病毒血症病毒N蛋白。进一步分析表明,该抗体识别的靶位点位于N蛋白第227~336位氨基酸之间。     

牛Cathelicidin BMAP-28基因的克隆及原核表达

根据GenBank中公布的牛BMAP-28基因mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从牛骨髓总RNA中扩增出BMAP-28基因片段,将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、酶切和测序分析鉴定,获得重组克隆载体pMD18-T-BMAP28.以重组质粒为模板,扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,转入原核表达载体PE...     

鸡新城疫病毒F基因片段的原核表达及其抗F蛋白单克隆抗体的制备

[目的]制备鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)抗原的单克隆抗体。[方法]克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段F306,经杂交瘤技术制备了抗F蛋白的单克隆抗体。[结果]首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以保存的重组质粒为模板,通过PCR扩增获得长度为306 bp的片段,再将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F306。其次经原核表达获得大小为35.8 kD的融合蛋白,提纯后免疫Balb/c小鼠。最后,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代和分泌抗NDV-F的抗体的杂交瘤细胞株。连续传代10次后,细胞上清和腹水的抗体效价仍维持在1∶5 124和1∶64 000以上。[结论]获得了2株稳定分泌抗鸡NDV-F抗体的杂交瘤细胞。     

IBV S1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法,以IBVM41毒株的S1基因为模板扩增出了大小为468bp的目的片段(命名为poly156S1),该片断保守性、抗原性较好。将获得的目的基因定向克隆到表达载体pET-32a-c(+)中,获得了重组质粒pET-32a-c(+)-poly156S1。将该重组质粒转入表达菌Origami(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,获得了大小约为34KD的重组蛋白poly156S1。Western-blot证实该重组蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。用纯化好的重组蛋白poly156S1免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行单克隆抗体的制备,成功获得了针对M41S1蛋白的3株单克隆杂交瘤细胞8D2、8D6、10F9,其IgG亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型。按常规方法对各株单克隆杂交瘤细胞进行了小鼠腹水单抗的制备与纯化,并用以重组蛋白poly156S1为包被抗原的间接ELISA对纯化后的腹水单抗进行了效价测定,及其与重组蛋白poly156S1亲和力的分析。结果表明:腹水单抗8D2、8D6、10F9的ELISA效价分别达到1.78×218,1.37×221,1.31×216;单抗8D6与重组蛋白poly156S1的亲和力最高。Western-blot进一步证实单抗8D6与重组蛋白poly156S1具有良好的反应性。     

肉鸡HSP70的基因克隆、原核表达及单克隆抗体制备

 【目的】制备高特异性的肉鸡热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）单克隆抗体,研究肉鸡HSP70与热应激损伤的关系。 【方法】 利用RT-PCR方法扩增肉鸡HSP70 mRNA,将其扩增产物克隆到PGEM-T Easy 载体和原核表达载体pET-28a(+)上,进一步转化至大肠杆菌BL-21中,用IPTG诱导表达重组肉鸡HSP70。以纯化的重组肉鸡HSP70制备多克隆抗体,免疫印迹分析说明重组肉鸡HSP70具有很好的免疫原性。以纯化的重组肉鸡HSP70免疫Balb/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。【结果】获得2株分泌肉鸡HSP70单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步通过免疫印迹分析筛选出1株高特异性的肉鸡HSP70单克隆抗体,命名为BH70-1。 【结论】免疫组织化学结果显示,单克隆抗体BH70-1是一种理想的抗体。     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

牛mettl3基因的原核表达与蛋白纯化

m~6A甲基转移酶(methyltransferase-like protein 3,METTL3)可调控m RNA的m6A甲基化水平,调节细胞蛋白质合成,实验室前期发现METTL3为乳腺上皮细胞乳合成重要调节分子,发挥泌乳调节作用。目前尚不清楚METTL3分子结构基础及其参与的调节机制。为揭示METTL3结构与功能关系,对METTL3蛋白作原核表达及纯化。研究采用PCR方法扩增牛mettl3基因完整CDS区,将CDS区插入原核表达载体p GEX-4T-1,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导METTL3蛋白大量表达,用8 mol·L-1尿素裂解包涵体,利用GST蛋白纯化试剂盒纯化诱导获得METTL3蛋白。SDS-PAGE证实GST-METTL3融合蛋白存在于包涵体内,试验获得高纯度GST-METTL3融合蛋白,为进一步研究METTL3蛋白在奶牛泌乳中作用提供重要依据。     

牛尿酸氧化酶基因的原核表达载体构建与表达研究

为了研究牛尿酸氧化酶(urate oxidase; EC 1. 7. 3. 3)的原核表达并优化表达条件,构建pETUO尿酸氧化酶原核表达载体,优化牛尿酸氧化酶的原核表达条件,对表达的尿酸氧化酶的活性进行测定.结果显示,表达的牛尿酸氧化酶大小为34 ku.在42℃的最适温度下,测定该酶活力达到9 U·mL-1.文中对原核表达牛尿酸氧化酶的意义做了进一步的探讨.     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

牛布鲁氏菌Wbkc基因原核表达及抗原性分析

克隆牛布鲁氏菌的甲酰基转移酶基因（Wbkc）,在大肠杆菌中表达/纯化,并对甲酰基转移酶的抗原性进行分析。以牛布鲁氏菌的染色体DNA为模板,扩增Wbkc基因,双酶切后克隆至pET-28a上,在大肠杆菌BL21中诱导表达,His Trap FF层析柱纯化,Western blot鉴定甲酰基转移酶的抗原性。提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。SDS-PAGE分析证明,表达产物为相对分子质量29 000的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有特异的免疫反应原性。     

牛eIF5基因原核表达与蛋白纯化

研究应用PCR方法扩增牛e IF5基因编码序列,通过Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-e IF5,并转化大肠埃希菌BL21。酶切和测序鉴定正确后,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-e IF5构建成功,Western Blot证实融合蛋白大量表达,纯化后获得GSTe IF5融合蛋白,为深入研究牛e IF5蛋白功能奠定基础。     

布莱凯特黑牛PID1基因的多态性分析及原核表达

为提高布莱凯特黑牛肉质品质,参照NCBI公布的牛PID1基因mRNA序列设计引物,以117头布莱凯特黑牛为试验材料,提取其眼肌总RNA,通过RT-PCR对布莱凯特黑牛PID1基因cDNA进行克隆测序,对PID1基因的每个外显子进行SNP检测,并分析其多态性。结果显示:布莱凯特黑牛PID1基因cDNA全长2 561bp,包括1个612bp的完整开放阅读框,编码203个氨基酸;在第2外显子上存在2处变异位点,但仅1处位点的突变引起氨基酸序列变化,表明PID1基因在种内保守性较强。