牛粪堆肥中反硝化细菌与理化参数的关系

以nos Z基因为标记,应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE)对牛粪堆肥过程中反硝化细菌群落结构进行研究,通过冗余分析(Redundancy analysis,RDA)法,分析反硝化细菌群落结构变化与堆肥过程中理化参数(堆体温度、pH、含水率、氨态氮和硝态氮)之间的关系。结果表明,反硝化细菌群落的Shannon-Weaver指数在堆肥0~4 d升高,在7~29 d减小。对优势条带进行测序发现Alcaligenes存在于整个堆肥过程中,判定其为此过程中优势菌属。反硝化细菌群落结构在堆肥前期(0~4 d)变化较小,而在降温腐熟期(23~29 d)变化剧烈。皮尔逊相关系数分析表明,反硝化细菌群落多样性与含水率呈极显著正相关关系(r=0.960,P0.01),与温度呈显著正相关关系(r=0.766,P0.05)。     

土壤nirS、nosZ型反硝化菌群落结构及多样性对牛场肥水灌溉水平的响应

以河北徐水县长期定位牛场肥水灌溉试验田为研究对象,采用末端限制性片段多态性分析(T-RFLP)和克隆文库相结合的方法,研究了不同施肥条件下0～20、20～40 cm土层中土壤nirS、nosZ型反硝化细菌群落结构特征变化。结果表明:nirS型反硝化细菌群落结构在0～20、20～40 cm土层中存在垂直分布差异,且0～20 cm土层中nirS群落结构对施肥种类、肥水浓度及灌溉次数不敏感,而20～40 cm土层中nirS群落结构对施肥条件敏感性提高;施肥处理和土层均对nosZ型反硝化细菌的群落结构产生显著影响。nirS、nosZ基因的多样性指数研究显示,施肥条件下nirS基因多样性指数未发生显著变化,但nosZ基因多样性指数有明显不同。相同施氮量(约300 kg·hm~(-2))的处理下,高浓度肥水灌溉(T5)相比常规施肥处理(CF)能更好地促进两土层中nosZ基因多样性发展。本研究还发现0～20 cm土层中的nirS、nosZ基因多样性指数均低于20～40 cm土层。本研究土壤中nirS型反硝化细菌主要与β-变形菌纲的固氮弧菌属(Azoarcus)、贪铜菌属(Cupriavidus)、红长命菌属(Rubrivivax)和γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas)和Rhodanobacter菌属具有较近的亲缘关系,少部分nirS型反硝化菌属于未知菌。土壤中nosZ型反硝化细菌主要与α-变形菌纲的根瘤菌属(Rhizobium)、β-变形菌纲的伯克氏菌属(Burkholderiales)和产碱杆菌属(Alcaligenes)、γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas)有较近的亲缘关系,少部分nosZ型反硝化菌属于未知菌。     

接种菌剂对牛粪堆肥反硝化细菌群落的影响

将具有木质纤维素降解能力的菌剂,接种到以牛粪和水稻秸秆为材料的堆肥中,通过测定温度、p H、C/N、种子发芽率、NH+4-N、NO-3-N相关指标,考察了接种菌剂堆肥和自然堆肥的腐熟情况;采用传统培养与PCR-DGGE技术相结合的方法 ,研究了接种菌剂对牛粪堆肥中反硝化细菌数量及nos Z-反硝化细菌群落结构多样性的影响。结果表明:两种堆肥都已完全腐熟,达到无害化标准,且接种菌剂堆肥更利于有机质分解,腐熟度更好;接种菌剂使可培养的反硝化细菌数量减少,nos Z-反硝化细菌多样性增加;自然堆肥中样品间相似性在50%~75%之间,接种菌剂堆肥样品间相似性在27%~76%之间,接种菌剂加快了反硝化细菌群落的演替。堆肥中nos Z-反硝化细菌包括γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、β-变形菌纲(β-proteobacteria)、未培养细菌(Uncultured bacteria)和α-变形菌纲(α-proteobacteria);接种菌剂堆肥中检测到自然堆肥不存在的反硝化细菌类群,这些类群分别属于盐单胞菌属(Halomonas)、固氮螺菌属(Azospirillum)、副球菌属(Paracoccus)、草螺菌属(Herbaspirillum)和产碱菌属(Alcaligenes),其中,产碱菌属、副球菌属中某些菌株的反硝化终产物为N2,减少了温室气体N2O的排放。     

鸡粪锯末好氧堆肥过程中硝化细菌动态变化

用鸡粪与锯末为原料进行高温好氧堆肥试验,研究不同初始含水率及堆肥方式下鸡粪锯末堆肥中铵态氮及硝化细菌动态变化,以期减少堆肥过程中氮素的损失,为优化堆肥提供理论依据。结果表明:1)硝化细菌存在于整个堆肥过程,且在堆肥腐熟期硝化细菌群落结构均发生了较大的变化。2)铵态氮浓度与硝化细菌群落物种丰富度与稳定性有关,可能是铵态氮会诱发硝化细菌生长。3)含水率是导致硝化细菌群落结构变化的关键因素。4)通过分析T-RF150、169和343bp对堆肥环境的适应性较强,且多数属于是不可培养的细菌菌属。5)通过分析可知T3处理有助于硝化细菌群落生长与稳定。     

好氧堆肥中amoA硝化细菌群落动态变化

为减少堆肥氮素损失,优化堆肥工艺,以牛粪和玉米秸秆为材料进行高温好氧堆肥,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和产物序列分析法,研究了堆肥不同阶段amoA硝化细菌群落结构组成和多样性的动态变化及与堆肥理化因子的相关性。结果表明:经高温期amoA硝化细菌类群发生明显演替,降温期检测到前期不存在的硝化类群,属于β-变形菌纲(β-Proteobacteria)中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)。堆肥过程始终存在的优势菌群属于β-变形菌(β-Proteobacteria)中的亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和不可培养细菌(Uncultured bacteria)。堆肥不同时期amoA硝化细菌多样性指数发生变化,升温至高温期减小,降温期增大,腐熟期减小。冗余分析(RDA)结果表明,铵态氮含量和温度与amoA硝化细菌群落结构组成显著相关(P0.05),是影响其动态变化的关键理化因子。     

好氧反硝化细菌的筛选及反硝化效率测定

从土壤中分离得到21株能以硝酸盐为唯一氮源提供的细菌,其中,能进行反硝化生成亚硝酸盐氮的细菌共12株,从中选择效果较好的2株作为研究对象,分别标记为DM-8和DM-13。研究其生长曲线、最适生长pH值范围,得到DM-8最适生长的pH值范围是6.0~8.0,DM-13最适生长的pH值范围是6.0~7.5。测定反硝化过程中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的浓度变化,DM-8和DM-13在培养48 h后,硝酸盐氮的去除率分别为33%和97%。     

鸡粪锯末好氧堆肥过程中主要指标及反硝化细菌动态变化

以鸡粪、锯末为原料进行高温好氧堆肥试验,研究不同初始含水率及堆肥方式下主要指标及反硝化细菌群落的动态变化规律,以期为控制堆肥过程中的氮素损失、提高堆肥肥效及保护农业生态环境提供理论依据。结果表明:1)反硝化细菌并非存在于整个堆肥过程且群落结构及物种组成变化性较大,而铵态氮是导致反硝化细菌群落结构变化的关键因素。2)在堆肥结束时T1~T5硝态氮浓度为0.24、0.28、0.29、0.27、0.25g/kg(即T3T2T4T5T1),而反硝化细菌群落的物种丰富度与稳定性分别是T1T5T2T4T3,反硝化作用决定堆肥过程中硝态氮的最终含量,初始含水率的降低有利于反硝化细菌群落物种丰富度与稳定性的提高。3)从农业生产的角度来说,T3处理(初始含水率70%,通风加搅拌)硝化细菌群落物种较丰富稳定性较高,反硝化作用较弱且硝态氮含量最高,T3处理用于农业生产较理想。     

基于高通量测序的鸡粪堆肥过程细菌群落结构分析

为通过相关功能微生物的应用,提高鸡粪堆肥效率及产品质量,本研究以鸡粪和菌渣进行好氧堆肥35 d,利用16S rRNA基因高通量测序技术分析鸡粪堆肥过程中细菌的群落结构动态变化。结果表明,在细菌门分类水平上,鸡粪堆肥过程中主要有厚壁菌门、拟杆菌门和盐厌氧菌门,其中厚壁菌门的相对丰度在鸡粪堆肥各时期均占主导地位,腐熟期相对丰度最高,拟杆菌门在腐熟期相对丰度最低,盐厌氧菌门在降温期相对丰度最高;在细菌纲分类水平上,鸡粪堆肥过程中主要有梭菌纲、芽孢杆菌纲和拟杆菌纲;α多样性相关分析表明,高温期堆肥中细菌菌群丰富度最高,群落多样性最大。综上,在鸡粪堆肥期间,细菌群落结构发生了明显变化。     

减氮对麦玉轮作农田土壤反硝化细菌群落结构和多样性的影响

探究减氮对华北地区麦玉轮作农田土壤反硝化细菌群落结构和多样性影响,为华北地区麦玉轮作农田氮肥管理提供技术支持,本研究以不施氮为对照（CK）,设置 2个施氮量,分别为常规施氮量（纯氮 300 kg·hm^-2,N2）、减氮 20%（纯氮 240 kg·hm^-2,N1）,提取土壤DNA,用nirS（细胞色素cd1-亚硝酸还原酶）、nirK（Cu-亚硝酸还原酶）引物扩增后采用MiSeq PE300测序技术,研究施氮量对麦玉轮作农田土壤性状及nirS、nirK反硝化细菌群落结构及多样性的影响。结果表明,3个处理nirS、nirK反硝化细菌α-多样性指数无显著差异,nirS反硝化细菌α-多样性高于nirK。减氮显著影响nirS、nirK反硝化细菌物种组成。减氮对nirS、nirK反硝化细菌门水平及nirK纲水平物种组成无显著影响,但显著降低了nirS反硝化细菌Deltaproteobacteria（δ-变形菌纲）相对丰度;减氮显著影响nirS、nirK属水平物种组成。硝态氮、速效磷、pH值是影响土壤nirS反硝化细菌属水平群落结构主要环境因子;pH值是影响土壤nirK反硝化细菌属水平群落结构的主要环境因子。研究表明,适量减氮不影响反硝化细菌α-多样性,但显著影响反硝化细菌属水平群落组成和群落结构,减氮主要是通过影响土壤性状及微生物群落结构进而影响农田土壤N₂O排放。     

一株高效好氧反硝化细菌的分离与鉴定

采用选择性培养基通过定量增加亚硝酸盐含量来富集筛选好氧反硝化细菌,经过选择性培养基初步筛选,测定NO-2-N与NO-3-N的去除率,再通过反硝化培养基复筛选出同时具有去除NO-2-N与NO-3-N能力的目的菌。通过16S rRNA基因序列分析及同源性比对以及与其他已筛选出的部分硝化细菌与反硝化细菌的比对构建系统发育树,结合菌株的生理生化鉴定试验,鉴定出目的菌株。在好氧、28℃培养条件下,在反硝化培养基中,该菌株5 d内将NO-2-N由3 570 mg/L降至22 mg/L,去除率达99.4%,将与NO-3-N由2 464 mg/L降至27 mg/L,去除率达98.9%。通过形态学、生理生化反应以及16S rRNA序列测定鉴定菌株DB-6为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae),命名为DB-6。新筛选的阴沟肠杆菌反硝化能力较强,具有生物脱氮的应用潜质,有望应用于海水养殖水质净化。     

牛粪堆肥中厌氧氨氧化菌分子生物学检测

研究利用PCR-DGGE方法对堆肥中厌氧氨氧化菌16S r RNA基因特异扩增,检测堆肥厌氧氨氧化菌种属及多样性水平。结果表明,牛粪堆肥中厌氧氨氧化菌群组成与海洋环境不同。海洋环境中Candidatus Scalindua属厌氧氨氧化菌为优势菌群,而牛粪堆肥中厌氧氨氧化菌中优势菌属为Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia和Candidatus Scalindua,多样性相对较高。可为堆肥发酵过程中厌氧氨氧化过程提供分子生物学依据。     

牛粪好氧堆肥中真菌群落组成的动态特征

采用高通量测序技术,探究牛粪堆肥过程中真菌群落时空动态变化、营养型及理化参数对真菌群落结构组成影响。结果表明,牛粪堆肥中未分类子囊菌门(Ascomycota)在升温期相对丰度最高,鬼伞属(Coprinus)和Guehomyces为高温期优势菌群,未分类子囊菌门为降温期优势菌属,未分类散囊菌目(Eurotiales)和Zopfiella为腐熟期优势菌群。在空间层次上,Guehomyces和未分类散囊菌目为上层和中层优势菌群,鬼伞属(Coprinus)和Zopfiella为下层优势菌群。在牛粪堆肥过程中腐生真菌相对丰度逐渐升高,堆肥下层相对丰度高于上、下两层。冗余分析(RDA)表明,含水率和温度对真菌群落结构变化影响显著(P0.05)。牛粪堆肥过程中真菌群落结构组成在不同时期和空间上均存在差异,堆肥内真菌群落多数为腐生营养型,真菌群落结构变化与理化因子相关。     

添加麦秸对鸡粪堆肥过程中氮素减排及细菌群落的影响

好氧堆肥是实现鸡粪资源化利用最主要的技术手段,然而在堆肥过程中氮素损失较为严重,既降低肥效又引起严重的污染。本文以纯鸡粪堆肥为对照,利用麦秸将鸡粪堆肥的C/N调节至15,分析了堆肥过程材料中理化性质、氮素转化和微生物群落变化,探讨了减少堆肥氮素损失的技术与机理。结果显示,加入麦秸后堆肥高温持续时间达到23 d,比对照延长了9 d,pH较对照组明显降低,氮素损失降低了39.67%。硝态氮含量达到281.99 mg·kg^-1,比对照增加了68.75%。微生物群落趋于稳定,具有硝化功能的细菌o＿＿Staphylococcales、o＿＿Brachybacterium、f＿＿Staphylococcaceae、g＿＿Staphylococcus、g＿＿Salinicoccus相对丰度比对照分别增加了88.45%、96.39%、88.45%、96.08%、79.20%,有利于堆体氮素保留和转化。试验结果表明,加入麦秸秆之后影响了鸡粪堆肥的细菌群落结构,增加了具有硝化功能的细菌丰度,从而减少了堆体氮素的损失。     

鸡粪菌渣好氧堆肥过程中氨氧化古菌及氨氧化细菌群落的动态变化

以amo A基因为标记,通过Real-Time PCR和限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)法对鸡粪菌渣好氧堆肥过程中的氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)和氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)进行了丰度及群落结构的分析。结果表明,在堆制初期、好氧发酵高温期及后熟期,AOB的amo A基因丰度均占主导优势,是AOA的38~992倍。进入好氧发酵高温期,AOA amo A基因丰度下降至发酵前的0.9%,AOB下降至17.6%,后熟期AOA与AOB的amo A基因丰度与好氧发酵高温期相当。在上述3个阶段AOA与AOB各自存在一个绝对优势菌群,分别为Cluster 3和Nitrosomonas europaea,其中Cluster 3克隆子数目分别占整个克隆文库的70.73%、54.28%、72.45%,Nitrosomonas europaea克隆子数目分别占整个克隆文库的78.44%、93.20%、94.27%。堆肥3个阶段AOA的多样性指数变化不大,Shannon-Wiener值维持在1.53~1.60,但群落结构发生明显演替,随着堆肥温度升高,堆肥前期的一些菌群(Cluster 4、Cluster 5、Cluster 6)逐渐消失,新的菌群Cluster 1出现并成为堆肥中后期的第二大优势菌群。AOB无论是多样性指数还是群落组成,都发生剧烈的变化。AOB在堆肥前期Shannon-Wiener指数值最大(1.47),种群数最多(6个基因簇,分别为Nitrosomonas europaea Cluster,Nitrosomonas halophila Cluster,Nitrosomonas communis Cluster,Nitrosomonas nitrosa Cluster,Nitrosospira briensis Cluster,Nitrosospira multiformis Cluster);进入高温发酵期,Shannon-Wiener下降至0.45,群落结构单一,只有Nitrosomonas europaea Cluster和Nitrosomonas halophila Cluster;进入后熟期,AOB多样性及种群数得到一定程度的回升。     

牛粪堆肥中氨氧化细菌群落结构及其与环境因子相关性研究

采用PCR-DGGE(聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳)和Real-time PCR技术,分析牛粪堆肥期间氨氧化细菌群落结构和数量的变化及其与理化因子的相关性。结果表明,在牛粪堆肥过程中氨氧化细菌数量变化范围为1.62×106~3.80×107copies·g-1,在第14d氨氧化细菌数量达到最高值;DGGE图谱显示,堆肥各个时期氨氧化细菌群落组成存在明显的差异;Shannon指数随着温度的变化而变化,在第7 d达到最大值2.671 8;系统发育分析表明,氨氧化细菌均隶属于β-变形菌纲不可培养的亚硝化螺菌属Uncultured Nitrosospira sp.和不可培养的亚硝化单胞菌属Uncultured Nitrosomonas sp.,其中与Uncultured Nitrosospira sp.相似性高的氨氧化细菌为优势菌,占60%左右;冗余分析(Redundancy analysis,RDA)显示,温度和铵态氮等对氨氧化细菌群落结构的影响较大。研究表明在牛粪堆肥期间氨氧化细菌群落结构发生了明显的变化,同时证实了氨氧化细菌群落结构的变化受堆肥理化因子的影响。     

干旱胁迫对马铃薯叶片内生细菌组成和结构的影响

为解析马铃薯应对干旱胁迫的响应机制，采用Illumina Novaseq测序技术，对干旱胁迫下马铃薯叶片中的内生细菌16S rRNA进行高通量测序，研究干旱胁迫下马铃薯叶片内生细菌组成及多样性的变化。结果显示，在正常浇水和干旱胁迫下马铃薯叶片分别获得1 548和2 006条分类序列，其中正常浇水下特有OTU有287个，干旱处理下特有OTU有769个。在干旱胁迫下，内共生菌 candidatus Portiera和杀雄菌属Arsenophonus的丰度较正常浇水下减低了95.9%和68.1%， 拟杆菌门Muribaculaceae拟杆菌目Bacteroidales、毛螺菌属（Lachnospira）、乳杆菌属（Lactobacillus）、毛螺菌科NK4A136群（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、根瘤菌属（Rhizobium）、螺杆菌属（Helicobacter）、链球菌属（Streptococcus）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）在干旱处理较正常浇水下分别提高了203.8%、152.4%、81.8%、89.7%、285.6%、1 428.0%、112.0%和148.4%；Shannon指数和Simpson指数均在干旱胁迫下显著高于正常浇水处理，ACE 指数和Chao1指数在干旱胁迫和正常浇水下无显著差异。结果表明，干旱胁迫能影响马铃薯内生细菌群落结构组成，干旱胁迫下富集了内生优势菌门放线菌门和厚壁菌门，同时伯克霍尔德氏科细菌相对丰度增加，可能是马铃薯应对干旱胁迫作出的积极响应。     

外源菌剂对茄子秸秆原位堆肥微生物群落结构影响及其相关性分析

为明确添加外源微生物菌剂对设施蔬菜秸秆参与原位堆肥的影响,以茄子秸秆为堆肥原料,通过设置添加A微生物菌剂300 kg·hm^-2（a1）,不添加微生物菌剂（ct）,添加B微生物菌剂300（b1）、600（b2）、900 kg·hm^-2（b3）5组处理,进行30 d蔬菜大棚原位堆肥试验,测定堆肥理化指标,并通过16S rDNA高通量测序技术分析堆肥过程细菌群落结构。结果表明：添加微生物菌剂能够提高堆肥温度峰值,提高堆肥期间pH下降和电导率上升的速率,显著提高全磷含量（P<0.05）,加快堆肥腐熟。堆肥后全氮含量比堆肥前提高,a1、ct、b1、b2处理的全氮含量分别上升了10.8%、11.6%、33.0%、18.5%,b3处理堆肥前后全氮含量无变化。堆肥结束时,处理a1、ct、b1、b2和b3的全磷含量分别为2.0%、2.0%、2.1%、2.2%和2.1%,b2处理显著高于其他处理（P<0.05）。添加微生物菌剂没有改变堆肥土壤优势菌群的门类,但显著改变了优质菌群的相对丰度,以及优势菌属的种类和相对丰度（P<0.05）。冗余分析结果表明全氮含量与厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度相关性较强,全磷含量、电导率与放线菌门（Actinobacteria）相对丰度相关性较强。相关性分析结果表明电导率、含水量和全磷含量是对耕层堆肥微生物优势菌群影响最显著的三个因素。研究表明,添加微生物菌剂有利于提高微生物群落多样性,对堆肥腐熟度和土壤养分的提升具有显著的促进作用。