农杆菌介导籼稻遗传转化研究的进展及策略

近年来,农杆菌介导法转化技术已广泛应用于粳稻遗传转化中。但是对籼稻遗传转化相对困难,由于水稻两个亚种遗传差异大,籼稻对转化反应的基因型依赖性强,愈伤组织诱导及分化率低。本文扼要回顾了农杆菌介导籼稻转化研究的历程,系统介绍了影响籼稻转化的主要因素,分析了农杆菌介导籼稻遗传转化研究中存在的问题,并提出了提高农杆菌介导籼稻遗转化效率的对策。高效籼稻转化体系的建立可以加速水稻转基因品种改良育种进程,推进水稻功能基因组研究的开展。     

根癌农杆菌介导水稻遗传转化研究进展及展望

自1994年建立了农杆菌介导的粳稻高效遗传转化体系以来,在短短十几年里取得了飞速发展。概述了农杆菌介导水稻遗传转化的研究历史和原理、影响农杆菌介导水稻转化体系的重要因素、转基因水稻的特点和外源基因的稳定性,并探讨了农杆菌介导水稻遗传转化研究中存在的问题与对策。     

根癌农杆菌介导籼稻高效遗传转化体系的构建

系统分析影响根癌农杆菌介导籼稻遗传转化的主要因素,比较不同培养基、培养条件、继代次数、菌液浓度、侵染时间等因素对籼稻遗传转化的影响,并组建一个高效的籼稻遗传转化技术体系。结果表明,成熟胚或幼胚经过NMB培养基诱导,NB培养基继代培养这样的培养基组合比较适合籼稻胚性愈伤组织的培养。在农杆菌介导转化时控制好菌液浓度、侵染时间以及分化培养基中KT和NAA的浓度配比,并进行预分化处理,可显著提高抗性植株的分化效率,减少白化苗的产生,最终使转化率提高到8%。     

小麦规模化转基因技术体系构建及其应用

在主要农作物中,小麦属于遗传转化比较困难的作物,转化效率较低,重复性较差,转化规模较小,优良转基因材料较少,基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物。目前,应用于小麦中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,有些实验室也采用花粉管通道、离子束注入、激光微束穿刺、PEG、花粉介导和农杆菌浸花等方法。在外植体利用方面,多数研究主要利用小麦幼胚及其愈伤组织作为起始转化材料,以成熟胚、幼穗、花药愈伤组织为材料转化成功的报道还比较少,需要进一步探索。在转化效率方面,基因枪报道为0.1%—16.7%,农杆菌报道为0.7%—44.8%,变化幅度较大。在目标基因转化方面,除了nptⅡ、bar、hpt、GUS、GOX、pmi、ALS等筛选基因和报告基因外,转化的功能基因主要涉及小麦品质、抗病性、耐旱性、抗蚜虫和抗除草剂等性状改良。农杆菌介导和基因枪介导转化小麦幼胚的转化效率除与受体基因型有关外,还与受体材料的生理状态有关,供体植株生长期间的温度条件、光照条件、营养条件和水分条件对转化效率有至关重要的影响,开花到幼胚取样期间适宜的昼夜温度有利于转化后胚性愈伤组织诱导和候选转基因植株的获得。从整体水平看,中国小麦转基因技术研究虽然取得了较大进展,如建立了小麦成熟胚高频率再生体系并应用于小麦转化,改进了小麦幼胚再生体系和转化体系,将一批抗病、耐旱和品质改良相关基因转入小麦,初步建立了小麦规模化转基因技术体系,但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为转化效率较低、基因型依赖性强、人工气候条件不够先进、转化队伍不稳定是限制中国小麦规模化转基因技术发展的瓶颈;建立主栽品种转化体系、提高转化效率、开展多基因转化、开发安全型转化技术、避免载体骨架序列插入、减少基因沉默、实现定点整合等是小麦转基因技术研究的发展趋势;通过对组织培养技术、植株再生和转化相关基因的研究,以及优良受体基因型筛选、培养基改良和各个转化影响因素的优化、集成等,克服农杆菌转化小麦的瓶颈,提高小麦转化效率,扩大转化规模。文章重点综述了基因枪和农杆菌转化技术在小麦中的应用和发展,回顾了近5年中国小麦规模化转基因技术研究进展,对于促进转基因小麦新品种培育和小麦功能基因组学研究具有一定参考价值。     

农杆菌介导水稻幼胚转化体系的建立

利用根癌农杆菌介导的转化方法对 3个粳稻品种的幼胚进行转化。在对影响根癌农杆菌转化水稻效率的多种因素进行比较研究后 ,优化转化条件 ,改进技术 ,建立了农杆菌介导的水稻幼胚转化体系。利用该体系 ,水稻品种秀水 11号的幼胚经预培养 4～ 7d得到的愈伤组织 ,用农杆菌EHA10 5 /pCAMBIA13 0 1感染后 ,筛选出潮霉素抗性愈伤组织并获得转化植株 ,潮霉素抗性愈伤组织获得率为 70 .76%。GUS染色及转基因植株总DNA的PCR检测结果表明 ,T -DNA上的外源基因已整合进了转基因水稻基因组中。     

农杆菌介导的小麦转化体系的优化

为建立农杆菌介导的高效小麦遗传转化体系,分析比较了不同小麦栽培品种、不同培养处理条件下的愈伤诱导、分化及转化效率。结果表明:2个长江中下游主推小麦品种扬麦158和华麦13的幼胚愈伤诱导没有差异,但扬麦158形成的胚性愈伤多、分化率及转化率高于华麦13,是优良的农杆菌介导的遗传转化受体基因型。预培养20d的愈伤转化率最高,高渗处理可进一步提高转化率。获得的T0、T1代转基因植株,经PCR分析鉴定,表明外源基因已经整合到小麦基因组中。     

高效抗虫基因PinⅡ转化水稻的研究

利用农杆菌介导的转化方法对1个籼稻品种和3个粳稻品种进行了转化。所用质粒为pCAMBI1300，其上带有马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ和高效启动子ACT I以及调节子Intron。通过添加有利于转化的物质乙酰丁香酮及影响转化的各因素(农杆菌的培养方法、共培养天数、愈伤组织诱导方法及继代次数)进行综合优化后，建立了农杆菌介导的水稻高效转化体系。将成熟胚用pCAMBI1300，LBA4404浸染后，筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生率最高达51．8％(粳稻)和31．5％(籼稻)，转化植株再生率最高达67．6％(粳稻)和47．5％(籼稻)。初筛苗中PCR阳性苗得率最高达33．3％(粳稻)和27．4％(籼稻)。PCR结果初步表明．Pin Ⅱ基因已整合到水稻基因组中。田间抗虫试验初步表明，阳性苗虫害率低于其受体亲本虫害率。本研究还在转基因水稻中发现了性状明显变异的植株，是进行水稻遗传背景分析和优良性状利用的宝贵材料。     

农杆菌介导的果树转基因研究进展

农杆菌介导法在果树遗传改良中有广阔的应用前景,农杆菌介导法的受体系统有原生质体、愈伤组织、直接分化芽和胚状体受体系统等;影响农杆菌转化频率的因素有侵染力,抗生素,基因型等;常用检测方法有GUS活性检测,PCR技术,杂交检测,免疫学检测.从农杆菌介导法在果树中的各种转化受体系统、影响果树基因转化的主要因素和转化植株的检测等方面进行综述,为不同果树建立高效的基因转化体系提供参考.     

农杆菌介导的水稻基因转化

以水稻的两个亚种籼稻和粳稻作为受体,比较了不同外值体、vir诱导物等对根癌农杆菌转化的影响,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。依据该体系,以粳籼DREW的幼愈伤组织和籼稻D汕B的幼穗愈伤组织为受体,经农杆菌AGL1／pCAMBIA1301转化后,获得了超过50%的潮霉素抗性愈伤筛选率,并获得再生植株。     

农杆菌介导的玉米自交系Z21遗传转化体系的研究

农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化效率一直是影响玉米转基因研究的重要因素。针对玉米自交系Z21,在外植体大小、农杆菌浓度和共培养时间等多个方面进行了探究。结果表明,在幼胚大小1.5~2.0 mm、农杆菌浓度OD_(600)为0.9~1.2、共培养3 d的条件下,Z21的外源基因表达效率最高。通过优化影响农杆菌介导转化的各种因素,初步建立了玉米自交系Z21的高效遗传转化体系。     

Breeding of Selectable Marker-Free Transgenic Rice Lines Containing AP1 Gene with Enhanced Disease Resistance

In order to obtain marker-free transgenic rice with improved disease resistance, the AP1 gene of Capsicum annuum and hygromycin-resistance gene （HPT） were cloned into the two separate T-DNA regions of the binary vector pSB130, respectively, and introduced into the calli derived from the immature seeds of two elite japonica rice varieties, Guangling Xiangjing and Wuxiangjing 9, mediated by Agrobacterium-mediated transformation. Many cotransgenic rice lines containing both the AP1 gene and the marker gene were regenerated and the integration of both transgenes in the transgenic rice plants was confirmed by either PCR or Southern blotting technique. Several selectable marker-free transgenic rice plants were subsequently obtained from the progeny of the cotransformants, and confirmed by both PCR and Southern blotting analysis. These transgenic rice lines were tested in the field and their resistance to disease was carefully investigated, the results showed that after inoculation the resistance to either bacterial blight or sheath blight of the selected transgenic lines was improved when compared with those of wild type.     

农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展

在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。     

棉花规模化转基因技术体系构建及其应用

文中综述了国内外转基因技术在棉花中的应用概况,主要介绍了近年来中国棉花规模化转基因技术体系的建立及应用研究进展,并对棉花转基因技术中存在的主要问题和未来发展趋势做了相关陈述。对棉花科研工作者了解棉花转基因研究进展并有效利用转基因技术开展工作具有重要意义。转基因技术在克服棉铃虫危害上取得了巨大成功,并将逐步在棉花抗病、抗逆等方面取得重要进展。世界上,棉花转基因初期主要建立了以珂字棉为受体的转基因体系,随着雷蒙德氏棉、亚洲棉、海岛棉、陆地棉等其他棉种组织培养体系的建立,农杆菌介导法、基因枪轰击法、花粉管通道法及其他转基因方法的应用,使得棉花转基因技术研究取得长足的进步。中国棉花规模化转基因技术体系主要是依托中国农业科学院棉花研究所及其他科研单位建立起来的,通过高效转化载体的筛选、主要棉花品种（系）的转基因技术体系的建立、组织培养条件的优化等措施,重点对农杆菌介导法转化棉花技术进行了改良,同时优化了基因枪轰击法及花粉管通道法转化技术,形成了三位一体的棉花规模化转基因技术体系。该体系建立了以中棉所24等材料为转基因受体的农杆菌介导体系,并利用叶柄组织培养筛选获得了组织培养分化率达100%的新材料W12等,使转化率提高到原有效率的2.88倍,同时建立了基因枪胚性愈伤组织轰击转化体系,并提高了花粉管通道的转化效率。该体系为棉花育种提供了大量材料,中国农业科学院棉花研究所已培育多个棉花抗虫新品种,并为国内41家科研单位转化基因200多个,验证了多个功能基因作用获得大量育种价值新材料。笔者认为基因型依赖性仍然是限制棉花规模化转基因技术发展的瓶颈,扩大棉花转基因受体材料基因型范围、提高转化效率、扩大转化规模是棉花转基因技术体系的长久主题。同时,为提高效率和降低安全性的公众焦虑,探索和发现新的更为安全和有效的转化体系,如多基因共转化、质体遗传转化、定点转化或基因叠加、开发安全型转化技术等研究引起人们的普遍关注,是未来棉花转基因技术的发展趋势。大量新基因处于材料阶段,同时安全性评价要求提高也需要转基因材料深入的研究。随着棉花基因组序列的公布,棉花自身基因的克隆将会成为棉花基础研究和应用研究的新方向,对于促进转基因棉花新品种培育和功能基因转化研究具有重要参考价值。     

农杆菌介导的明恢63转化体系的建立

本试验优化了籼稻的农杆菌遗传转化系统,并以明恢63为材料进行了遗传转化.结果显示,从1 100块愈伤组织中获得133块抗性愈伤,其抗性愈伤率为12.7%,分化率为81.3%,所获取的转基因植株后代的分离绝大多数符合孟德尔遗传规律.因此,此系统是一个较好的农杆菌介导的遗传转化系统,可用于基因功能验证、新基因在后代的遗传方式及共转化培养marker-free转基因植株.     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

Genetic and agronomic traits stability of marker-free transgenic wheat plants generated from Agrobacterium-mediated co-transformation in T_2 and T_3 generations

Genetically modified wheat has not been commercially utilized in agriculture largely due to regulatory hurdles associated with traditional transformation methods. Development of marker-free transgenic wheat plants will help to facilitate biosafety evaluation and the eventual environmental release of transgenic wheat varieties. In this study, the marker-free transgenic wheat plants previously obtained by Agrobacterium-mediated co-transformation of double T-DNAs vector were identified by fluorescence in situ hybridization(FISH) in the T_1 generation, and their genetic stability and agronomic traits were analyzed in T_2 and T_3 generations. FISH analysis indicated that the transgene often integrated into a position at the distal region of wheat chromosomes. Furthermore, we show that the GUS transgene was stably inherited in the marker-free transgenic plants in T_1 to T_3 generations. No significant differences in agronomic traits or grain characteristics were observed in T_3 generation, with the exception of a small variation in spike length and grains per spike in a few lines. The selection marker of bar gene was not found in the transgenic plants through T_1 to T_3 generations. The results from this investigation lay a solid foundation for the potential application of the marker-free transgenic wheat plants achieved through the co-transformation of double T-DNAs vector by Agrobacterium in agriculture after biosafty evaluation.     

无抗性选择标记转AP1基因抗病水稻新品系的选育

 为获得无任何抗生素抗性基因的抗病转基因水稻新品系，将克隆自甜椒的两亲性蛋白AP1基因与潮霉素抗性选择标记基因（HPT）分别构建位于同一农杆菌双元载体上的两个独立的T-DNA区中，并经农杆菌介导，将其导入江苏省推广的两个粳稻品种广陵香粳和武香粳9号中，获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明，AP1基因和HPT基因已同时导入受体基因组中，并从共转化植株的自交后代中筛选到了无HPT基因的转AP1基因水稻植株。结合田间农艺性状考察，选育了多个无抗性选择标记基因的纯合转AP1基因水稻新品系；抗病性鉴定结果表明，转AP1基因水稻对稻白叶枯病的抗性与未转化对照相比有显著提高，部分转基因水稻对纹枯病的抗性与未转化对照相比也有一定程度的提高。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。