三倍化复制对白菜花粉特异表达候选基因的影响

【目的】研究三倍化复制事件后白菜花粉特异表达候选基因的进化情况,为研究白菜的花粉特异表达基因提供理论依据。【方法】利用Syn Orths软件及拟南芥花粉特异表达基因集,通过共线性分析获取白菜中的花粉特异表达候选基因。通过Interpro Scan获取这些候选基因的GO注释,并将这些GO注释划分到与花粉相关的13个大类。然后统计每个GO的基因数占不同拷贝类型基因总数的比例,对不同拷贝类型间进行比较。进一步根据白菜3个亚基因组集,将这些候选基因划分到不同的亚基因组上。通过分析白菜花粉特异表达候选基因中串联重复基因与拟南芥基因的共线性关系,推测这些串联重复基因是在芸薹属特有的三倍化事件之前形成,还是在其之后形成。【结果】通过对拟南芥中的1 651个花粉特异表达基因进行共线性分析,在白菜中总共找到了1 962个花粉特异表达候选基因。拟南芥特异基因集里有182个串联重复基因,而白菜包含了137个串联重复基因。白菜与拟南芥在花粉特异表达基因数目上没有明显差异,因此推测这些基因的大部分拷贝可能在三倍化复制事件后发生了丢失。549个拟南芥花粉特异表达基因在白菜上找不到相应的共线性基因,白菜在进化过程中可能丢失掉了这部分基因。拟南芥花粉特异表达基因中有898个串联重复基因在白菜中对应单或多拷贝的非串联重复基因。在白菜中对应单拷贝基因的拟南芥基因数目为480个,而且所占比例高达53.5%。另外,322个基因在白菜中对应两拷贝,比例约为35.8%。而在白菜中对应三拷贝的拟南芥基因只有96个,大约占总数目的 10.7%。在白菜中,单拷贝和两拷贝的基因数目显著高于三拷贝,这说明三倍化后白菜中大部分花粉特异候选基因发生了丢失,部分两拷贝和三拷贝的基因也可能处于进化选择的过程中。白菜三拷贝基因功能在7个GO分类上的比例高于单拷贝和两拷贝,而白菜两拷贝在所有GO分类上都有分布。白菜花粉特异候选基因中的大部分串联重复基因可能在三倍化事件以后发生了基因丢失,变成了非串联重复基因。也有部分非串联重复基因在三倍化事件之后形成了串联重复基因。【结论】白菜花粉特异候选基因在芸薹属特有的三倍化事件之后处于进化之中,并且三倍化事件可能促进了3种拷贝类型基因的功能差异。     

苹果MdMYB9、MdMYB11表达及其蛋白互作分析

【目的】克隆苹果(Malus domestica)中的TT2同源基因MdMYB9和MdMYB11,分析它们的序列特征,并对这两个基因在不同组织器官及光诱导条件下的表达特性及蛋白互作进行分析,为进一步解析这两个基因的功能奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法分离得到MdMYB9和MdMYB11;利用DNAMAN软件对这两个蛋白的分子量、等电点等进行预测及对氨基酸序列进行分析,同时利用MEGA4.0软件构建这两个蛋白与拟南芥R2R3家族MYB蛋白的系统进化树;利用定量PCR检测这两个基因在不同组织器官、不同发育时期苹果果皮及种子和光照处理条件下的表达特性;利用酵母双杂交检测这两个MYB蛋白与花青苷合成相关蛋白MdbHLH33之间的互作关系。【结果】序列分析显示,MdMYB9开放阅读框长度为873 bp,编码290个氨基酸残基,与拟南芥TT2序列同源性为38.13%;MdMYB11开放阅读框为861 bp,编码286个氨基酸残基,与TT2同源性为32.44%;蛋白结构分析显示,MdMYB9和MdMYB11蛋白的N端都含有保守的R2R3功能域;进化树分析显示,这两个MYB蛋白都与拟南芥原花青苷合成相关蛋白TT2聚在同一个分支;荧光定量结果表明,MdMYB9和MdMYB11在苹果根、茎、叶和花中均有表达,但各器官中表达水平存在差异;同时,这两个基因在不同发育时期的种子及果皮中都有表达,其中均在发育中期表达水平最高;此外,光照诱导条件下MdMYB9和MdMYB11的表达变化无明显差异。酵母双杂交结果显示,MdMYB9和MdMYB11均能够与花青苷合成相关蛋白MdbHLH33相互作用。【结论】苹果MdMYB9和MdMYB11属于R2R3类MYB蛋白,在不同组织器官及不同发育时期的果皮和种子中都有表达,并与MdbHLH33蛋白相互作用。     

苹果MdJAZ1基因表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因MdJAZ1,并对其表达及蛋白互作进行分析,为进一步研究MdJAZ1的功能奠定基础。【方法】以TIFY及Jas功能域为探针,在苹果基因组中进行比对,获得多个同源基因,对其中的一个基因设计引物进行克隆;利用DNAMan软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测;利用SMART在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析;利用MEGA5.0对该蛋白与拟南芥JAZ家族蛋白构建系统发育树;利用荧光定量PCR分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况;利用Plant CARE在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件;利用酵母双杂交系统检测MdJAZ1蛋白的二聚化及其与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。【结果】MdJAZ1开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸残基,其蛋白的分子量为40.536kDa,等电点9。氨基酸序列分析显示,该蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域;系统发育树分析显示,MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近;qPCR结果显示,MdJAZ1在苹果的根、茎、叶、花及果实等组织中都有表达,但表达水平存在明显差异,其中根中的表达量最高,果实中的表达量最低;该基因还能被茉莉酸甲酯及创伤处理诱导表达,均在1 h内达到最高表达水平;启动子分析显示,MdJAZ1启动子中包含多个ABA、乙烯、抗病及逆境胁迫等响应元件,此外,还包含多个MYB结合位点;酵母双杂交结果显示,MdJAZ1蛋白能与其自身相互作用形成同源二聚体,还可与拟南芥中同源性较近的AtJAZ3、AtJAZ4蛋白相互作用形成异源二聚体,并且在冠菌素存在时,MdJAZ1蛋白可与拟南芥F-box蛋白AtCOI1相互作用。【结论】MdJAZ1受茉莉酸甲酯及创伤诱导表达,其蛋白能形成同源及异源二聚体,且在冠菌素存在时可与AtCOI1互作。     

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析Gm MYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据获得盐胁迫响应显著上调(27倍)的Gm MYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与Gm MYB76、Gm MYB12a以及苜蓿Mt MYB61的亲缘关系最近;Gm MYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,Gm MYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,Gm MYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,Gm MYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示Gm MYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,Gm MYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】Gm MYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。     

大白菜BrARGOS基因的分离与功能分析

 【目的】从大白菜自交系日喀则的叶片中分离新的拟南芥ARGOS的同源基因,进行氨基酸序列比对和该基因的表达模式分析,转化拟南芥分析其功能,并分析该基因的表达量与大白菜叶杂种优势之间的关系。为在大白菜中研究该基因的功能提供依据。【方法】利用RT-PCR从大白菜叶中分离出ARGOS同源基因的cDNA序列,采用DNAMAN软件分析该基因所编码的蛋白质的二级结构,通过半定量RT-PCR检测该基因在大白菜各器官中的表达水平,分析转基因拟南芥的表型鉴定该基因的功能,通过半定量RT-PCR分析该基因的表达量与大白菜叶的杂种优势之间的关系。【结果】根据拟南芥ARGOS序列,通过Blast检索到大白菜BAC库中的序列,根据该序列设计特异引物,以提取自日喀则叶片的RNA反转录产物为模板,通过PCR扩增出1个新的ARGOS的同源基因BrARGOS。对大白菜、拟南芥和番茄中3个基因所编码的蛋白质做序列比对分析发现,这3个蛋白质的C末端富含亮氨酸。BrARGOS蛋白的二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋。通过半定量RT-PCR分析,在大白菜各器官中均检测到BrARGOS基因的表达,在果荚中表达量最高,其次为子叶,茎生叶中表达量最低。通过PCR检测阳性转化体拟南芥基因组显示,NPTⅡ基因已经转入拟南芥基因组中,表明外源BrARGOS基因也同时转入拟南芥基因组中。与转空载体对照拟南芥相比,过量表达BrARGOS基因的转基因拟南芥的叶、花、叶鲜重和株高均显著增大/高。【结论】从大白菜自交系日喀则叶片中分离了1个新的ARGOS的同源基因BrARGOS,并分析了BrARGOS基因的表达模式和功能。在拟南芥中过量表达BrARGOS基因使拟南芥的地上器官显著增大。大白菜BrARGOS基因可能与调节植物器官大小有关。     

超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果(Malus domestica‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和PCR技术,分离细胞分裂素响应基因Md CRF6。使用MEGA 5.0软件构建苹果Md CRF6与拟南芥CRFs间系统进化树;通过SMART软件和DNAMAN软件分析Md CRF6蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应。通过电泳迁移率试验(EMSA),验证Md CRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建Md CRF6植物超表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md CRF6苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定Md CRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域,在C端包含保守的AP2/ERF结构域,并且与拟南芥At CRF6同源性最高。基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl处理3 h和6 h时表达量最高。EMSA试验结果验证Md CRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列。在苹果愈伤组织中超表达Md CRF6,发现Md CRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示,Md CRF6显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果Md CRF6与拟南芥At CRF6具有高度的同源性,其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达Md CRF6抑制其花青苷积累,降低植物抗盐性。推测苹果Md CRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调节花青苷积累和抗盐性。     

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

【目的】利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。【方法】根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物，对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。【结果】获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现，该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示，该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交，结果表明，其在基因组中存在多拷贝。【结论】本研究成功获得了不结球白菜RGA序列，为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ），并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体，通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中，经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株，用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测，并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp，包含有2 733 bp的开放阅读框，编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明，所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构，同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测，证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高，且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列，揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定，为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

黄瓜耐镉相关基因CsNAC019的克隆及表达分析

【目的】研究黄瓜耐镉(Cd)分子机制,结合生物信息学分析获得一个NAC转录因子家族基因CsNAC019,对其进行克隆和表达分析,为进一步将该基因用于黄瓜耐Cd品种的改良与选育提供试验基础。【方法】通过PCR技术扩增CsNAC019全长;利用NCBI和DNAMAN进行序列比对和保守结构域分析;利用Expasy、TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、稳定系数、亲水系数分析;通过Plant CARE在线工具进行启动子序列分析;采用MEGA 6.0软件根据NJ方法,构建系统进化树;采用q RT-PCR技术检测Cd胁迫后黄瓜CsNAC019在叶中的表达情况,并用DPS 7.05数据处理系统软件进行方差及显著性分析。【结果】CsNAC019含有典型的NAC保守结构域。通过BLAST分析比对,该基因在氨基酸序列上与拟南芥NAC019存在60%的同源性,两者在从N端到C端有A、B、C、D、E 5个氨基酸相对保守区的序列高度一致。该基因CDS序列全长为960 bp,编码319个氨基酸,编码蛋白质分子量为35.66 k D,理论等电点为8.72,不稳定系数为68.18,平均亲水系数为-0.483。启动子分析表明,除含有真核生物启动子固有的TATA和CAAT元件外,CsNAC019的启动子序列还存在G-box、ABRE、W-box、P-box、TCA-element、TC-richrepeats、HSE等多种响应逆境胁迫的顺式元件。系统进化分析表明,CsNAC019与甜瓜、桃、苹果、柑桔、葡萄、大豆等15种植物NAC转录因子有64%—96%的同源性,其中与甜瓜的NAC蛋白同源性最高,为96%。通过q RT-PCR分析发现,与对照相比,CsNAC019在Cd胁迫条件下表达量明显上调(8.2倍)。【结论】CsNAC019为黄瓜Cd胁迫诱导表达基因,推测其可能通过调节下游基因的表达调控黄瓜对Cd胁迫的应答。     

普通烟草CDPK基因家族的克隆及表达分析

 【目的】从烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通烟草CDPK基因,结合已有的报道,目前在普通烟草中获得了15个CDPK基因,为在基因组范围内研究普通烟草CDPK基因家族的功能奠定了基础。     

白菜类作物开花时间的全基因组关联分析

【目的】解析白菜类作物开花时间的调控位点,定位白菜类作物开花时间相关的候选基因,为白菜类作物抽薹开花时间的遗传改良提供依据。【方法】以116份白菜类作物组成的自然群体作为研究材料,分别种植在温室与露地2个独立的环境中,进行开花时间调查。同时,提取试验材料的DNA样品进行深度为1.2x的重测序,对测序数据用Pooled Mapping法进行过滤、与参考基因组比对,获得全基因组高密度SNP集合。经过条件过滤后,对高质量的SNP集合进行生物信息分析,包括试验材料的群体结构分析和全基因组连锁不平衡分析。从高质量的SNP集合中,随机挑选出2 000个变异位点,用Phy ML软件以最大似然法对116份试验材料进行系统发育树分析。用全部的高质量SNP集合位点通过软件Haploview进行全基因组连锁不平衡分析。最后,将高质量的SNP集合与开花时间数据结合,通过TASSEL和GAPIT软件包以及R程序语言进行全基因组关联分析。根据强关联峰值信号点位置和连锁不平衡区间定位开花时间候选位点,再通过白菜与同源物种拟南芥的基因共线性关系以及基因功能注释分析来预测白菜类作物开花时间相关的候选基因。【结果】不同种植条件下、不同类型的白菜类作物在开花时间上存在广泛差异。试验材料在露地环境下的开花时间高峰期明显早于温室环境下的材料;试验材料在露地环境下的开花时间总体表现出偏正态分布,而在温室环境下,开花时间各个阶段呈现出较为均衡的分布。温室与露地环境下的开花时间呈显著正相关。通过生物信息学分析最终得到的高质量SNP位点共103万个。试验材料的群体结构分析表明在系统发育树上各亚群内部分布较为集中,不同亚群之间的分布与材料的地理起源密切相关。全基因组衰减平均LD为2.3 kb,表明在116份白菜类作物构建的群体内存在较为频繁的重组和突变。对不同条件下的开花时间进行全基因组关联分析,用复合模型检测到54个(P4)强关联峰值信号点,一般模型检测到87个(P5)。通过进一步分析强关联信号点的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)区段,得到存在强连锁关系(r20.33)的峰值信号点共33个(温室环境下27个,露地环境下19个)。其中,在温室与露地环境下的共定位位点13个。根据33个关联候选位点,再通过白菜与同源物种拟南芥的基因共线性关系以及基因功能注释分析筛选出白菜类作物开花时间相关的候选基因14个,其中温室与露地环境下共定位候选基因3个(FUL、PHYB和FPF1)。在露地条件下定位到开花关键基因FT1。【结论】不同条件下开花时间的相关性分析表明,遗传效应在开花早晚中起着决定性作用。全基因组关联分析共鉴定出33个与开花时间相关的显著关联信号。通过连锁不平衡分析、白菜与同源物种拟南芥的基因共线性关系以及基因功能注释分析初步鉴定出14个白菜类作物开花时间相关的候选基因。     

甘蓝型油菜COI1的调控功能分析

【目的】研究甘蓝型油菜中茉莉素受体复合体核心成员CORONATINE INSENSITIVE 1(COI1)蛋白的基因表达特性及生理调控功能。【方法】利用基因组数据分析甘蓝型油菜及其亲本种白菜和甘蓝基因组的COI1构成情况;使用定量和半定量RT-PCR扩增方法检测油菜COI1的组织特异性表达;克隆油菜COI1保守区片段,构建病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)载体,以农杆菌侵染方法培育VIGS诱导COI1沉默的油菜植株,然后,用鉴定出的COI1沉默植株研究油菜COI1在育性调控及虫害抗性等方面的调控功能。【结果】基因组数据分析表明,甘蓝型油菜亲本种白菜和甘蓝共有7个高度同源的COI1,依序列同源性可分为4类:COI1a、COI1b.1、COI1b.2和COI1c;甘蓝型油菜有8个COI1,也由上述几类同源基因组成。半定量和定量RT-PCR扩增试验表明甘蓝型油菜COI1在茎中的表达水平最低。从培育的VIGS诱导COI1沉默油菜中,共鉴定出COI1表达水平被抑制超过70%的株系25个,其中抑制效果最明显的10个株系被用于育性调控及蚜虫抗性试验。育性分析结果证明,VIGS沉默COI1油菜的结实能力受到严重影响,其角果在授粉20 d以后的长度只达到对照油菜角果授粉5 d后的长度,且角果中无正常种子;沉默COI1油菜的雄蕊长度短于相同花期的对照油菜雄蕊,其花药开裂延迟;显微观察发现,沉默COI1油菜的花粉中有超过80%呈不正常形态。在相同处理条件下进行的蚜虫抗性比较试验中,沉默COI1油菜叶片上的蚜虫数量超过对照油菜1倍多,而且有很多小蚜虫围绕大蚜虫的虫落,繁殖态势比对照油菜叶片上的蚜虫旺盛。【结论】甘蓝型油菜COI1具有组织特异表达特性,沉默COI1会导致油菜雄性不育性状发生,并降低油菜植株对蚜虫的抗性。     

芸薹属物种（B. napus,B. oleracea,B. rapa） MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。     

甘蓝光敏色素B基因的克隆及在拟南芥中异源转基因的功能验证

【目的】甘蓝(Brassica oleracea L.)是世界上最广泛种植的蔬菜作物之一,其种植已由春、秋两季种植转变为四季栽培,因此,研究甘蓝对光温的反应能力是品种改良的重要基础。光敏色素是植物最重要的一类光受体,主要响应远红光和红光的变化,其中,光敏色素B是红光的最主要受体,与光形态建成、避荫性以及生物产量等性状密切相关。克隆甘蓝的光敏色素B基因(Bo PHYB),在拟南芥中验证异源基因Bo PHYB在光形态建成和避荫性反应中的作用,丰富植物光敏色素基因功能研究,评价光敏色素在甘蓝品种改良中应用的潜在价值。【方法】利用RT-PCR的方法克隆、测序验证得到甘蓝自交不亲和系12C的Bo PHYB编码区c DNA序列;利用生物信息学软件分析其编码的氨基酸序列及结构域,并与其他植物的光敏色素B进行序列比对,分析它们之间的同源关系;构建其35S启动子驱动的植物表达载体p JIM19-Myc-Bo PHYB,通过农杆菌介导法转化拟南芥野生型Col-0和phy B-9突变体,并获得纯合转基因株系;比较Bo PHYB与拟南芥光敏色素B(At PHYB-GFP)的转基因株系在不同光质下的下胚轴伸长和成株期的表型,验证其在光形态建成和避荫性反应中的作用。【结果】从甘蓝中克隆了Bo PHYB的编码区c DNA序列,该基因编码区含有3 507个核苷酸,编码具有1 168个氨基酸残基、分子量为128.9 k D的蛋白质;与拟南芥和白菜的phy B结构域类似,Bophy B包含1个GAF结构域、2个PAS结构域、1个His KA结构域和1个HATPase_c结构域;氨基酸序列同源性分析发现,Bophy B与拟南芥以及白菜的phy B同源性最高,与小麦、玉米、水稻等单子叶植物的同源性较低;与At PHYB-GFP类似,在红光和白光下不但Myc-Bo PHYB能互补phy B-9极端黄化的表型,而且转基因株系均表现为下胚轴加剧缩短;长日照和短日照下成株期转基因导致植株矮化、叶片深绿和叶柄缩短。【结论】克隆了甘蓝光敏色素B基因,甘蓝光敏色素B与拟南芥和白菜的光敏色素B具有相似的结构和功能,在红光和白光下促进幼苗的去黄化反应,在成株期显著抑制长日照和短日照下植株的避荫性反应。     

玉米大斑病菌Homeobox转录因子家族全基因组鉴定及其表达规律分析

【目的】从全基因组水平上鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Homeobox转录因子家族及其分布,阐明该家族的序列及进化特征,分析该家族基因在病菌不同生长发育时期的表达规律。【方法】利用生物信息学手段搜索玉米大斑病菌全基因组数据库,鉴定Homeobox转录因子家族;采用MEGA 5.0软件进行系统进化树分析;利用在线工具GSDS(gene structure display server)(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图;利用Clustal X 1.83软件分析Homeobox保守结构域(HOX保守结构域)的氨基酸序列特征;利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)对Homeobox蛋白的二级结构进行在线预测;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析Homeobox转录因子家族在病菌不同发育时期的表达模式。【结果】在玉米大斑病菌中鉴定了8个Homeobox转录因子家族成员(St HTF1-8),根据基因结构及系统进化特征将其分为4类;亚细胞定位预测分析表明,这8个蛋白全部定位在细胞核中;该家族成员均含有HOX保守结构域,其二级结构具有特征性的"螺旋-转角-螺旋"(helix-turn-helix)结构;利用q RT-PCR技术对该家族成员在菌丝、分生孢子形成、芽管形成、附着胞及侵入丝形成等5个时期的表达规律分析,发现不同基因在病菌不同发育时期具有不同的表达水平,其中St HTF1在菌丝发育、分生孢子及附着胞形成等3个时期的表达水平相对较高,St HTF3、St HTF4在分生孢子形成时期表达水平最高,St HTF6在芽管形成时期的表达水平最高,St HTF2、St HTF5、St HTF7和St HTF8在附着胞形成时期的表达水平均较高。【结论】玉米大斑病菌包括Homeobox转录因子家族包含8个成员,在进化上分为4大类,全部成员均分布在细胞核内,其编码蛋白质均含有保守的HOX结构域及"螺旋-转角-螺旋"空间结构;该基因家族成员在病菌不同发育时期呈现不同的表达规律。     

芥菜型油菜类黄酮合成相关基因的克隆和序列分析

 【目的】分离和克隆芥菜型油菜类黄酮合成相关基因。【方法】采用同源克隆基因的方法，参照拟南芥等植物控制类黄酮合成的基因保守序列设计引物，对扩增片段进行测序并进行BLAST分析。【结果】有13对引物扩增的17个基因拷贝与参考基因序列相符，这些克隆属于13个已知功能基因，其中查尔酮合成酶基因有3个不同的基因拷贝，花色素形成（Production of anthocyanin pigment）基因和查尔酮异构酶基因分别有2个不同的基因拷贝，其余引物的扩增只获得一个拷贝。在GenBank数据库中进行检索表明，所克隆的基因拷贝中的DNA结合/转录因子基因(TT2、TT8、TTG2) 、花色素形成基因（PAP）和黄烷酮-3-羟化酶基因（TT6），在芸薹属植物中未见报道。【结论】克隆芥菜型油菜类黄酮合成相关基因拷贝为阐明油菜种皮颜色形成的遗传调节奠定了基础。     

苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析

【目的】探究苦荞全生育期芦丁含量变化与其合成途径关键酶基因和调控因子MYB基因表达量之间的相关性,以期进一步明确苦荞植株体内芦丁生物合成的分子机制。【方法】以九江苦荞为试验材料,整个生育期分别在萌发期、子叶期、真叶期、盛叶期、现蕾期、盛花期、灌浆期和籽粒成熟期共8个时期取材(S1—S8)。采用RT-PCR方法,克隆获得与黄酮类代谢相关的MYB类转录因子基因。采用T-coffee软件进行氨基酸同源序列比对及保守结构域分析。与拟南芥黄酮类代谢相关的MYB转录因子及荞麦同源MYB转录因子序列比对,基于邻近法构建系统进化树;实时荧光定量PCR技术分析芦丁合成途径中5个关键酶Ft CHS、Ft F3H、Ft4CL、Ft FLS-like和Ft UFGT及上述克隆到的MYB转录因子在不同组织中的表达模式。基于高效液相色谱法(HPLC)测定全生育期取材组织的芦丁含量。同时采用相关性分析方法分析不同组织中芦丁含量变化与基因表达模式的相关性。转换上述数据为矩阵,采用欧式距离法构建共表达层次聚类图谱。【结果】克隆到2个MYB类转录因子,即Ft MYB7和Ft MYB9,其核酸序列长度分别为876和912 bp,分别编码291和303个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比对分析结果表明,二者均具有典型的R2R3保守结构域,为R2R3类型的MYB转录因子。结合Nr数据库中17个苦荞和3个拟南芥黄酮类代谢相关MYB转录因子同源氨基酸序列构建系统进化树,结果表明这22个基因分成6大类群,其中Ft MYB7属于第II类群,Ft MYB9属于第IV类群,二者分属于不同类群,暗示这2个MYB转录因子可能涉及调控植物生长发育过程中不同功能类型。荧光定量结果显示,Ft MYB7在S3(真叶期)和S5(现蕾期)基因相对表达量最高,达到501和867倍;Ft MYB9在S1(萌发期)和S2(子叶期)相对表达量最高,分别为34和72倍。上述基因表达量与芦丁含量变化模式相关性分析表明,8个生长时期中,Ft4CL、Ft CHS、Ft F3H、Ft UFGT和Ft MYB7相对表达模式与芦丁含量变化幅度呈正相关,其相关系数分别为0.748、0.683、0.704、0.890和0.862。而Ft FLS-like和Ft MYB9与芦丁含量的变化幅度呈负相关,其相关系数分别为-0.442和-0.501。【结论】Ft MYB7和Ft MYB9转录因子在整个生育时期中表达模式存在明显差异。其中Ft MYB7可能在苦荞芦丁积累的过程中起到正调控作用,而Ft MYB9则为负调控作用。     

玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索c AMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和黑曲霉(Aspergillus niger)6种真菌PDE基因的保守序列,利用简并引物PCR对基因保守片段进行扩增,结合RACE和Genome Walking技术获得基因全长及其侧翼序列;利用MEGA 5.0软件对PDE蛋白预测编码产物进行多重序列比对,并采用邻近法构建系统发育树;利用GSDS分析基因结构,Prot Param分析理化性质,SOMPA预测二级结构,SMART数据库在线分析保守结构域;收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用q RT-PCR技术研究StPDE在病菌侵染结构形成过程中不同阶段的转录水平。【结果】玉米大斑病菌基因组中存在1个高亲和力磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1个低亲和力磷酸二酯酶基因(StL-PDE)。其中,StH-PDE全长3 208 bp,包含5个内含子和6个外显子,ORF为2 898 bp。StL-PDE全长5054 bp,包含4个内含子和5个外显子,ORF为3 090 bp。StH-PDE和StL-PDE分别含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型c AMP磷酸二酯酶催化结构域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分别呈现出高度的相似性,其中,StH-PDE与Magnaporthe grisea、Cordyceps militaris、Metarhizium acridum等病原真菌的高亲和力磷酸二酯酶基因聚于同一进化支,StL-PDE与Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album等病原真菌的低亲和力磷酸二酯酶基因聚于相同进化支。人造疏水介质诱导下,与菌丝相比,StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表达水平均显著上调,其中StH-PDE和StL-PDE分别上调了约2倍和52倍。孢子萌发初期两个基因表达水平显著下调,随着萌发的进行,表达水平缓慢回升,至附着胞形成阶段,基因表达出现了第2次高峰,随后表达水平再次下调。在整个过程中,StH-PDE的最高表达水平则出现在附着胞形成时期,达到了菌丝体中的近7倍、分生孢子中的近2倍,而StL-PDE的表达水平始终低于其在分生孢子中的表达水平。StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主过程中的表达水平变化趋势与其在人工疏水介质诱导下的表现基本一致。在孢子萌发早期表达显著下调,随着时间延长,缓慢回升,至接种后18和24 h StH-PDE表达水平上调,超过萌发初期。【结论】在病菌侵染结构发育过程中,StH-PDE和StL-PDE均呈现下调-上调-下调的表达水平变化趋势。StH-PDE在附着胞时期表达水平最高,StL-PDE在分生孢子中的相对表达水平最高。