奶牛孕酮酶联免疫检测试剂盒的研制

为了掌握母牛孕酮水平变化信息,为发情鉴定、妊娠鉴别和卵巢疾病诊断提供参考依据,根据EHSA基本原理,研制了奶牛孕酮ELISA检测试剂盒。结果表明,采用孕酮-牛血清白蛋白（P4-BSA）交联物解决了在酶标板上包被抗原的问题,且抗原容易保存;而利用孕酮-卵清白蛋白（P4-OVA）交联物免疫兔子获得高效价抗体,能阻断1ng/mL孕酮水平;并以ELISA棋盘测定法确定P4-BSA 2000倍、血清500倍稀释为该试剂盒最佳工作浓度。该试剂盒以牛粪作为检测样品,即通过粪便中的孕酮水平变化可为奶牛发情鉴定、妊娠鉴别、繁殖障碍性疾病诊断提供可靠的技术支撑。     

奶牛孕酮—卵清蛋白交联物、孕酮—牛血清白蛋白交联物的制备

采用碳二亚胺法合成孕酮—卵清蛋白交联物(P4-OVA)、孕酮—牛血清白蛋白交联物(P4-BSA);用孕酮—卵清蛋白(P4-OVA)交联物作为抗原免疫兔子,获得高效价抗体;用孕酮—牛血清白蛋白交联物(P4-BSA)作为包被抗原,通过牛血清白蛋白将抗原牢固地连接在酶标板上,包被后的抗原在4℃保存一年使用效果良好。为奶牛孕酮检测ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

奶牛孕酮间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]为孕酮检测试剂盒的研制奠定基础。[方法]采用二环己基碳化二亚胺法制备检测抗原,建立了检测奶牛孕酮含量的间接竞争ELISA方法。[结果]检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA的最佳反应条件确定为:最佳包被浓度为100 ng/ml,碳酸盐缓冲液的包被效果较好,以4℃过夜+37℃2 h佳,最佳封闭液为2%山羊血清,酶标抗体的工作浓度为0.13μg/ml。建立的标准曲线方程为y=-1.844 4x-0.140 1(R2=0.981 7),检测范围为0~20 ng/ml,最低检测限为0.58 ng/ml。该标准曲线的批内变异系数和批间变异系数分别为2.22%和2.37%。[结论]该研究建立了定量检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA方法。     

奶牛生殖激素的分析——Ⅰ.一天三次挤奶及分乳区挤奶乳汁孕酮含量的比较

本文采用大样本生物统计法分析了306份奶牛乳汁孕酮放射免疫测定结果,表明从四个乳区及一天三次挤奶所采的乳样中孕酮的含量均无显著差异(P>0.05),但早晨和下午挤奶时末乳混合乳中的孕酮含量明显比奶桶混合乳的要高(P<0.05,P<0.001)。一天三次挤奶所采奶桶混合乳的孕酮含量与末乳混合乳的相关与回归关系极显著(P<0.001)。     

Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响

为明确Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的作用,采用荧光定量PCR和ELISA方法研究了Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果表明:Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞的孕酮分泌有促进作用,且在一定范围内呈剂量依赖性。100 nmol/L Kisspeptin-10(Kp-10)处理颗粒细胞24 h后,显著增加了孕酮的分泌(P0.05),而10 nmol/L和1 000 nmol/L Kp-10处理组对孕酮的分泌无显著影响(P0.05)。100 nmol/L Kp-10可显著提高孕酮合成的关键基因3β-HSD和St AR的mRNA表达水平(P0.01)。研究结果提示,Kisspeptin可促进牛卵巢颗粒细胞孕酮的分泌,推测这一作用可能通过上调孕酮合成关键基因表达来实现。     

奶牛孕酮单克隆抗体的制备及其酶免疫测定方法的初步建立

[目的]制备奶牛孕酮McAb,建立孕酮酶免疫检测方法,为研制检测试剂盒奠定基础。[方法]用琥珀酰亚胺法将孕酮与钥孔血蓝蛋白(KLH)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备完全抗原,免疫BalB/c小鼠,建立杂交瘤细胞株制备McAb,对McAb特异性、亚类、交叉反应性及相对亲和力等进行鉴定,筛选最佳McAb,建立酶免疫检测方法。[结果]获得3株杂交瘤1F6、2G6和2A11,腹水效价依次为1∶1×106、1∶1×105和1∶8×104,其中1F6为IgG2b亚型,2G6和2A11为IgM亚型,3株McAb都能和游离孕酮发生特异性反应,相对亲和力1F6>2G6>2A11,其中1F6对雌二醇的交叉反应率小于0.01%。选用1F6与酶标孕酮建立ELISA检测方法,制作标准曲线,检测范围为0.5~100.0ng/ml。[结论]该研究制备的单克隆抗体,可用于建立孕酮酶免疫检测方法,为奶牛孕酮水平的定量监测提供了较实用的方法。     

醋酸甲羟孕酮单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

建立饲料和食品中醋酸甲羟孕酮(MPA)残留快速、灵敏的检测方法.分别以碳二亚胺法、混合酸酐法合成MPA的人工抗原MPA-BSA、MPA-OVA为免疫原和包被原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗MPA单克隆抗体(McAb),在Protein G Sepharose 4 Fast Flow纯化MeAb基础上通过对ELISA反应条件的优化建立了MPA检测的间接竞争ELISA方法,并对MPA标品添加试样进行了初步应用.结果获得1株能稳定分泌抗MPA McAb的杂交瘤细胞株M68F9H9,分泌McAb腹水效价为1∶1×107,属于IgGl亚类,MPA半数抑制浓度(IC50)为5.0 ng/mL,具有良好特异性;以纯化McAb为基础建立的间接竞争ELISA,MPA最低检测限为0.16 ng/mL,线性检测范围为0.1～80 ng/mL;除与甲羟孕酮、甲地孕酮、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和已烯雌酚交叉反应率分别为100%、25%、<0.01%、<0.01%和<0.01%;MPA添加试样应用检测结果与进口试剂盒检测结果相符.     

奶牛产犊胎次与乳中孕酮、雌二醇含量的关系

用放射免疫法测定了50头中国荷斯坦牛产后23d内及发情前后12d内乳中的孕酮(P)和雌二醇(E2)的含量。结果表明:产后23d内不同胎次的奶牛孕酮,雌二醇含量差异不显著,而产后不同天数之间的孕酮、雌二醇含量差异极显著(P<0.01)。不同胎次间发情前后12d内的孕酮、雌二醇含量差异不显著(P>0.05),而发情不同天数之间的孕酮、雌二醇含量差异极显著(P<0.01)。     

不同发情周期阶段施用前列腺素F_(2α)对豚鼠卵巢活动的作用

应用放射免疫测定方法和组织学方法,对豚鼠在不同发情阶段施用前列腺素F_(2a)后,血液中孕酮和雌激素以及黄体和卵泡的大小进行了测定。在排卵后相对静止期(如情期第2天),外源性PGF_(2a)对正在形成的黄体形态上没有显著影响,但抑制孕酮分泌,对雌激素分泌没有影响;黄体发育期(如第5天,第8天),外源性PGF_(2a)对黄体发育、孕酮和雌激素的分泌都有抑制作用;黄体退化期(如第11天、第14天),外源性PGF_(2a)对孕酮和雌激素都没有影响,早期还有促进黄体退化作用,以后就没有这种作用。任何情期阶段,外源性PGF_(2a)对卵泡形态发育都没有显著影响。这些结果同时也说明,外源性PGF_(2a)对豚鼠没有缩短周期提前发情排卵的作用。文中还对豚鼠发情周期的划分和外源性PGF_(2a)不能缩短豚鼠发情周期的原因等问题进行了讨论。     

胎衣不下奶牛胎盘中孕酮和雌激素含量变化的研究

通过研究胎衣不下奶牛胎盘组织中孕酮和雌激素的含量变化,探讨了奶牛发生胎衣不下的内分泌学机制.将20头奶牛分为健康对照组和胎衣不下组,分别采集健康奶牛和胎衣不下奶牛的胎儿胎盘,制备胎盘组织匀浆液,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其中的孕酮和雌激素的含量.结果发现,胎衣不下组奶牛胎盘组织中的孕酮含量高于健康对照组奶牛,差异极显著(P<0.01);而雌激素含量低于健康对照组,差异极显著(P<0.01).表明胎盘组织中孕酮和雌激素的含量与奶牛胎衣不下的发生密切相关.     

新疆部分地区奶牛(牦牛)流产病因分析研究

[目的]诊断分析和静县巴伦台镇牦牛与博乐市郊区奶牛流产病因.并以商品试剂盒检测结果为标准,对比常用犬新孢子虫病的诊断方法.[方法]分别使用N .caninum Antibody Test kit、自建rELISA检测方法和PCR检测方法,进行犬新孢子虫病检测.同时使用虎红平板凝集试验、试管凝集试验,检测该地区布鲁氏病流行情况.[结果]和静县巴伦台镇牦牛流产病因主要为布鲁氏杆菌感染,其感染率为72.7;.博乐市郊区奶牛流产病因主要为新孢子虫病感染,其感染率为25;.[结论]应用GST-NcSAG1t抗原蛋白的rELISA检测法和PCR诊断技术为灵敏度高,特异性较强.和静县巴伦台镇牦牛与博乐市郊区奶牛流产病因分别为布鲁氏杆菌和新孢子虫感染引起,应加强防范.     

蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究

 为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-ELISA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.（双侧）=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD 公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。     

兽药残留检测中试剂盒的验证评判方法研究

试剂盒是应用酶联免疫技术研发的新一代药物残留检测产品,与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点,操作时间仅需1.5 h,能最大限度地减少操作误差和工作强度。但是应用试剂盒时检测结果与有些试剂盒所标示的各项技术指标相差甚远,出现假阳性的几率很大,有必要在兽药残留检测中确定试剂盒指标评判的具体内容和方法。     

氦氖激光对正常母黄牛血液及发情的影响

研究的结果证明,氦氖激光对母黄牛照射前后,其体温、脉搏、呼吸无明显变化。血红蛋白呈明显的一时性下降,从照射的第2～3天开始逐日下降,至第8～9天下降到最低值,然后从第10天开始逐日回升,直至停照后第六天基本恢复照前值。红细胞总数变化与血红蛋白的变化规律基本一致。白细胞总数呈升高趋势,有明显起伏。白细胞像呈嗜酸性白细胞显著升高,淋巴细胞低其他各种白细胞无明显变化。对休情期母黄牛有明显的促进发情作用,九头试验牛有八头发情(89%),其中妊娠期发情牛两头,发情牛能否排卵,有待今后进一步探讨。出现发情的时间比较集中,这对今后研究黄牛发情同步化及改良都有一定的现实意义。     

用线性评分法对黑白花奶牛(Holstein)的外貌评定

奶牛体型的线性评分法是近年发展起来的新方法。他是利用直线刻度来度量奶牛休型的２个极端的全过程，然后对照活体按线性方式排列比较，最后根据体型性状的实际表现状态进行评分的。利用此方法对内蒙古农业大学教学牧场黑白花奶牛进行评定的结果表明，牛群整体分数淡高，但比较整齐，按鉴定结果进行排队，决定其种用价值，对该牛群的改良与提高起一定的作用。     

氦氖激光麻醉的研究 Ⅵ.氦氖激光照射黃牛的正中神經、胫神經及眶下神經鎭痛效果的观察

本文介绍了氦氖激光照射黄牛的正中神经,胫神经及眶下神经和马一样也取得了较为满意的镇痛效果。在8头实验牛身上作的30例实验性手术证明,其镇痛效果判定为优者8例(26.7％),良者18例(60％),尚可者3例(10％),失败者1例(3.3％)。其中镇痛效果判定为优良的总和为26例(86.7％)。但总的说来其镇痛效果较马的差。在切皮时有半数的实验牛有不同程度的疼痛反应,切割或剪断术区较大神经时,实验牛也和马一样出现搔动不安。但总的说来,该法简便易行,效果可靠,可在临床上推广应用。     

影响奶牛子宫复旧因素的研究

应用电测径器、B-型超声实时断层扫描仪(B-超)以及放射免疫等仪器和技术,对19头产后娟珊牛和50头荷兰黑白花牛的子宫复旧过程、规律以及影响其复旧速度的因素进行了研究。结果表明,两个品种正常牛子宫孕角、空角和子宫颈复旧的平均时间分别为32.3±2.1,28.0±3.6,38.3±4.0(娟珊牛)和35.5±4.5,30.8±5.9和37.5±5.0(黑白花牛)。两个品种牛子宫角直径大小分别和血浆中3甲基组氨酸(3MH)和羟基脯氨酸(HP)的含量呈显著(r=0.39,P<0.05)和极显著(r=0.52,P<0.01)正相关;产后患子宫感染及胎衣不下的牛,子宫复旧时间比正常组牛极显著延长(P<0.01)。产后脂肪肝的发病率为63.2%(娟珊牛)和46.7%(黑白花牛)。患脂肪肝的娟珊牛子宫复旧的时间比同品种正常牛显著延长(P<0.05)。娟珊牛产后第1次排卵的平均时间是13.2±1.2 d;黑白花牛为15.4±3.0 d。2个品种牛产后第1次排卵时间和子宫复旧时间呈显著正相关(r=0.64,P<0.05)(正常组牛)和非显著负相关(r=-0.53,P<0.2>0.1)(患子宫病组牛)。产后48h1次性肌肉注射外源性激素后,除雌二醇可显著延长子宫空角复旧的速度外,孕酮、催产素和前列腺素 F_(2α)(PGF_(2α))对子宫复旧速度均无显著影响。     

母牛发情周期和妊娠早期宫颈-阴道粘液电导率变化规律的研究

 本文应用自行设计安装的MFR-1型母牛发情鉴定及早期妊娠诊断仪，将特制探测电极插入母牛阴道穹窿部，测定了94头母牛宫颈-阴道粘液的电导率（CVMEC）。结果表明，母牛在发情周期和妊娠早期CVMEC呈规律性变化。发情周期正常的母牛，CVMEC在间情期处于较低水平（5.64mS/cm），前情期开始上升（8.93mS/cm），发情期达峰值（13.40mS/cm），后情期开始下降（9.84mS/cm），最后降至间情期水平。输精后，未妊与妊娠母牛CVMEC的变化规律不同。在发情周期的各时期，未妊母牛高于妊娠母牛；未妊母牛在输精后21天左右返情，CVMEC再度出现峰值；妊娠早期母牛则保持与间情期相近的较低水平（5.08mS/cm）。笔者认为，母牛CVMEC的规律性变化的生理学基础是体内激素水平和宫颈-阴道粘液的周期性变化，据此进行发情鉴定和早期妊娠诊断是可行的。与目前使用的方法相比，CVMEC法更具有实用价值。     

母牛抗精子抗体与繁殖性能的关系

本试验用Kibrick和F-D试验法分别测定了母牛体内抗精子抗体的效价,结果处女牛普遍低;屡配不孕牛高;而怀孕牛中只有少数偏高。一些不孕牛经两种方法同时测定,其结果相似。对一组不孕牛同时测定了发情时子宫粘液和血液中的抗精子抗体,发现子宫粘膜(液)中同样可产生和存在着类似抗体。5头阳性不孕牛,分别用4头无血缘关系的公牛精液进行试验,其结果相似,没有发现精液的来源不同(公牛的血型)与这些牛的不孕有什么相关。     

黑白花奶牛初乳中G6PDH GOT与乳腺分泌机能关系的研究

本文研究黑白花奶牛初乳中葡萄糖-β-磷酸脱氢酶(G6PDH),谷草转氨酶(GOT)、三氮醋酸沉淀蛋白(TCA-P)的动态变化,以及G6PDH,GOT与乳腺分泌机能的关系。结果表明:G6PDH,GOT,TCA-P在初乳7天的分泌模式为y=Ax~(-b)。初乳中每次挤奶乳样的G6PDH总量的7天平均值与日产乳量(3个月平均)存在显著正相关(r=0.7163,n=14,P<0.01);G6PDH与TCA-P的相关系数为r=0.7183(n=35).GOT与TCA-P的相关系数为r=0.8642(n=35)。本研究认为,黑白花奶牛初乳中的G6PDH、GOT活性可反映乳腺在初乳阶段的分泌机能,并可作为预测乳产量的指标。