从老化病组织中高效分离大豆疫霉菌的方法

【目的】建立从老化病组织中高效分离大豆疫霉菌的方法,为大豆疫霉菌的群体遗传研究奠定基础。【方法】2006～2007年分别调查黑龙江和新疆大豆根腐病的发生情况,分别用病组织直接分离法和新建立的病组织浸泡分离法从采自黑龙江和新疆病样中分离大豆疫霉菌,统计分离率。【结果】建立的病组织浸泡法为:用NaOH处理采集的病样,通过镜检卵孢子的方法确定大豆疫霉病,排除镰刀菌、丝核菌或其他杂菌的干扰;浸泡病组织刺激卵孢子的萌发,用大豆叶碟诱集游动孢子侵染,下胚轴接种染病叶碟至感病大豆,最后从染病大豆胚轴分离病菌。采用此方法从采自黑龙江和新疆的205个已确认为大豆疫霉菌侵染的根腐病病样中,获得共计145个分离物,直接分离法和组织浸泡法平均分离率分别为21.4%和49.3%,总体分离率平均为70.7%。【结论】建立了从老化病组织中高效分离大豆疫霉菌的方法,降低了分离成本。     

新疆大豆疫霉菌的毒力组成研究

为明确大豆疫霉菌在新疆的分布和新疆大豆疫霉菌的毒力组成,采用大豆叶碟诱捕法从新疆大豆田土壤中分离大豆疫霉菌,并采用幼苗下胚轴伤口接种法鉴定大豆疫霉菌的毒力。结果共分离到26个大豆疫霉菌株,毒力测定鉴定出20个不同的毒力型,说明新疆的大豆疫霉菌表现出丰富的毒力多样性。新疆大豆疫霉菌对抗病基因Rps1a,Rps1c和Rps1k的毒力频率均为0,因此,可应用这3个抗病基因对新疆大豆疫霉根腐病进行有效控制。     

大豆疫霉菌的土壤诱集分离检测技术研究

利用大豆叶片可以诱集到土壤中的大豆疫霉菌（Phytophthora sojae)。诱集前土壤在－7℃低温下处理10h，诱集过程中适当加大水面与土面的距离，强日光辐射1.5-4h，可以得到P.S侵染的大豆叶碟，杂菌污染少，该方法适于P.s的诱集分离。在预培养前对土壤进行36℃处理4h,，加水使土壤含水量至饱和状态，光照条件下预培养后加入感病叶片，在4000lx光照下培养10－12h，可以最大限度地检测出土壤内的P.s菌量。用含有对土壤中P.s有抗性基因（Rps)的大豆叶片则诱集不到P.S或者仅能诱集到少量P.s，且P.s在叶碟上只形成不成熟的孢子囊。     

新疆大豆疫霉的来源分析

应用SSR标记对新疆地区大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufmann ＆ Gerdemann）的遗传多样性和与美国、黑龙江、福建等3个不同地理来源大豆疫霉菌的遗传关系进行研究。结果表明，新疆地区大豆疫霉菌遗传多样性相对较低，遗传背景单一，推断为外来生物。与大豆疫霉菌美国分离物和福建分离物相比，新疆分离物与黑龙江分离物的遗传关系最近，表明新疆大豆疫霉菌可能从黑龙江传人。     

中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究

 通过大豆疫霉根腐病发生的田间调查、从病株和土壤中分离大豆疫霉菌 ,对大豆疫霉菌在我国的分布进行了研究 ,结果表明 ,除东北地区外 ,我国黄淮流域和长江流域也存在大豆疫霉菌。应用 13个鉴别寄主 ,对来自不同地区的 83个大豆疫霉菌分离物进行毒力鉴定 ,证明我国大豆疫霉菌存在丰富的毒力多样性。与植株分离物相比 ,土壤分离物的毒力多样性程度更高。对不同地区来源分离物的毒力组成比较表明 ,长江流域分离物的毒力多样性最丰富 ,其次是黄淮流域 ,而东北地区分离物的毒力组成相对简单。     

我国部分地区大豆疫霉群体遗传分析

为探究我国大豆疫霉菌的遗传多样性,使用13对简单重复序列标记(simple sequence repeats,SSR)引物对来自部分地区的79个大豆疫霉菌分离物进行了DNA指纹分析.13对SSR引物共扩增出33条条带,其中多态性条带比例为97.0%.SSR指纹聚类分析表明:当以相异距离0.79为阈值时,可将79个大豆疫霉菌分离物划分为13个遗传聚类组.多数大豆疫霉菌分离物之间遗传相似性较低,表明我国大豆疫霉在DNA水平上发生了显著的遗传变异,从而具有较丰富的遗传多样性.大豆疫霉菌DNA多态性特征与分离物地理来源之间存在一定相关性,说明不同地区的大豆疫霉菌群体与大豆栽培品种之间的互作很可能是引起大豆疫霉菌发生广泛遗传变异的主要原因.     

呼伦贝尔盟大豆疫病病原菌鉴定

对采集到的大豆疫病１８个样本分别进行了分离比纯和形态鉴定，结果表明，该地区大豆疫是由疫霉属大豆疫霉菌引起，经过致病性测定，发病率为１００％。     

新疆大豆疫霉菌毒力及大豆品种抗病性

对34株大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)新疆分离物进行了毒力鉴定,发现新疆疫区大豆疫霉菌毒力结构复杂,不同地块之间、同一地块不同大豆疫霉菌分离物间都存在毒力差异.用7个不同毒力的分离物接种鉴定了19个新疆地区栽培大豆品种(系)的抗病性,其中10个品种(系)表现较好的抗性.     

用SSR标记和巢式PCR快速检测大豆疫霉菌

 【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R，建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性，引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242 bp的特异片段，在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增，检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50 pg?μl-1，而巢式PCR的灵敏度为50 fg?μl-1;巢式PCR检测土壤中卵孢子的灵敏度为每克土壤0.4个卵孢子;巢式PCR能够特异地从大豆病株和土壤中检测到大豆疫霉菌。【结论】基于SSR标记建立的巢式PCR方法能够用于大豆疫霉菌的快速检测和病害诊断。     

大豆疫霉菌对大豆幼苗致病性的遗传变异研究

【目的】研究黑龙江省大豆疫霉菌的致病性特性及其遗传变异特点,为进一步探讨大豆疫霉菌致病力的遗传变异机制奠定基础。【方法】用国际标准鉴别寄主和黑龙江省部分主栽大豆品种测定黑龙江省大豆疫霉菌株的致病性,以大豆疫霉野生型菌株的单游动孢子分离物为亲本,建立连续2代单游动孢子无性后代和1代单卵孢后代,测定大豆疫霉菌致病力的遗传变异特性。【结果】黑龙江省大豆疫霉菌株对黑龙江省大豆主栽品种表现出不同的致病性,但对国际标准鉴别寄主不致病。控制大豆疫霉菌致病力的某些致病基因在连续2代单游动孢子后代和1代单卵孢后代中发生变异,而其他致病基因遗传稳定。【结论】黑龙江省大豆疫霉菌株和大豆品种具有美国大豆疫霉菌株和大豆品种所不具有的更为复杂的遗传多样性,用国际标准鉴别寄主鉴别黑龙江省大豆疫霉菌株的致病性存在明显的局限性。控制大豆疫霉菌的致病基因分布在不同位点,有的遗传稳定,由纯合的核基因控制;有的遗传不稳定,由杂合核基因或细胞质基因控制,其有性和无性后代均发生变异。     

用多克隆抗体检测纯培养和植物体内的大豆疫霉菌

用大豆疫霉 Phytophthora sojae菌丝可溶性蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清 ,用间接EL ISA 方法测定其与 Phytop hthora sojae、Phytophthora capsici、Phytophthora inf estans、Phytophthora cactorum、Phytophthora cinnamomi、Phytophthora citrophthora、Phytop hthorap arasitica、Phytophthora palmivora 8个疫霉种的 2 3个纯培养菌株的反应 ,同时检测 31株大豆疫霉人工接种发病植株体内的病原菌。结果表明 ,该多克隆抗血清对大豆疫霉纯培养的检测准确率高达 94 % ,对人工接种发病植株体内目标病原菌的检出率达 80 % ,可用于检测大豆疫霉     

中、草药水提取物抑菌活性的测定

以辣椒疫霉菌、立枯丝核菌、番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、大豆疫霉菌、番茄叶霉菌、烟草赤星病菌及玉米小斑病菌为供试菌种 ,用 30种中、草药的水提取物对其进行了抑菌活性测定。结果表明 ,大蒜提取液对立枯丝核菌、辣椒疫霉菌丝生长抑制率达 10 0 % ;猪胆汁对辣椒疫霉菌丝生长抑制率达 93.2 2 % ,对大豆疫霉菌丝生长抑制率达 80 .94 % ;金银花提取液对大豆疫霉菌丝生长抑制率达 10 0 % ;连翘提取液对大豆疫霉菌丝生长抑制率达 76 .10 % ;L S- 1为本课题组自行研制 ,由苦参、黄柏、蛇床子等 10余种中药组成 ,其对番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌及大豆疫霉菌丝生长抑制率为 10 0 % ,对辣椒疫霉菌丝生长抑制率达 81.4 6 %以上 ,在病菌孢子萌发的抑制作用中对番茄枯萎病菌、番茄叶霉及玉米小斑病菌孢子萌发抑制率分别达到 90 .71% ,85 .71%和 77.14 %。     

大豆疫霉(Phytophthora sojae)单卵孢株毒性纯系的建立

将培养30d的大豆疫霉1号生理小种卵孢子在适宜条件下诱导萌发,随机挑取30个单卵孢株进行纯培养和毒力测定,在测定结果与亲代一致(1号生理小种)的菌株中随机选取1个单卵孢株重复上述试验。试验经过连续两代单卵孢株分离培养,获得了毒力稳定表达的大豆疫霉1号生理小种单卵孢株毒力纯系,为开展大豆疫霉毒性遗传和变异的分子生物学研究提供了研究材料。     

大豆疫霉基因组SSR标记开发

 【目的】开发大豆疫霉基因组SSR标记,为从分子水平深入研究大豆疫霉及其近缘种提供一种理想的分子标记。【方法】用FPCR软件从大豆疫霉全基因组序列中查询SSRs,选择合适的SSR序列用Primer5.0软件设计引物。【结果】从发现的1 234个含有2～4个碱基重复单元的完全SSRs中选出260段设计引物,经10个大豆疫霉分离物基因组DNA检测,有213对(81.9%)扩增出SSR特征条带,其中114(53.5%)对引物扩增出多态性。通用性检测表明,14.6%～28.6%引物分别在选择的8个疫霉种中有效扩增。基于10个SSR标记数据进行聚类分析,结果表明表明这些标记可以完全区分大豆疫霉及其它疫霉。【结论】大豆疫霉基因组SSR标记具有高多态性,是大豆疫霉遗传变异、遗传多样性、及遗传图谱构建等研究理想工具。部分大豆疫霉基因组SSR标记在其近缘种中具有通用性,可以用于疫霉菌的系统进化、鉴定、区分及开发近源种的SSR标记。特别开发的SSR标记,在大豆疫霉基因组中具有准确的位置,将极大地方便大豆疫霉菌功能基因的定位和克隆,以及进行疫霉菌的比较基因组的研究。     

诱导大豆疫霉菌大量产生游动孢子囊的最佳方法研究

大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)是疫霉菌中难在培养条件下形成孢子囊的菌种之一。对诱发大豆疫霉菌产生游动孢子囊的10种方法进行比较研究,结果表明,供试的10种方法除了MSS溶液法外均能诱发产生游动孢子囊,其中以土壤浸出液法和皮氏液加土壤浸出液法效果最佳,产孢量大,所需的时间最短,游动孢子囊成熟度一致,且能一次性释放出游动孢子,从而成功地解决了大豆疫霉菌产生孢子囊难这一重要问题。     

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究大豆抗疫霉根腐病的分子机制

文章以中国优良大豆品种东农46及大豆疫霉优势生理小种1号菌株为材料,利用mRNA差异显示技术研究东农46与大豆疫霉根腐病菌非亲和互作中前后基因表达的差异,寻找并分离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的9条cDNA片段,通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。     

大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)生理小种研究进展

综述了大豆疫霉菌 (phytophthora sojae)的生理分化和生理小种的研究进展,包括传统的毒性分析到分子技术的应用,探讨了小种鉴定中发现的无毒菌株的成因及其特征。     

一种大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)纯营养菌丝的培养方法

比较了胡萝卜琼脂和玻璃纸胡萝卜琼脂培养大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)对菌丝生长速度、卵孢子产生、孢子囊产生时间及RNA提取效果的影响。结果表明,玻璃纸胡萝卜琼脂培养的大豆疫霉菌,10 d内不会产生卵孢子,当大豆疫霉菌从玻璃纸上取下时,不会带有培养基,能够提取出高质量的RNA,满足差异显示反转录PCR对RNA质量的要求,是一种适合大豆疫霉菌纯营养菌丝的培养方法。