利用等位基因特异性PCR检测水稻可溶性淀粉合酶基因的单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(SNP)广泛分布于水稻基因组中,SNP分型已成为水稻遗传作图、关联分析、资源鉴定和分子标记辅助选择等研究的重要技术.本文选择水稻可溶性淀粉合酶基因SSⅢa的12个SNP位点,研究了利用等位基因特异性PCR法检测SNP的可行性.按照等位基因特异性PCR原理设计引物3'末端碱基,并根据每个SNP位点引物3'端的错配类型,在上游引物3'末端第3位引入不同的错配碱基,结果均获得了很好的扩增特异性,PCR检测结果与测序结果吻合.表明,等位基因特异性PCR是一种简便、快捷、可靠和低成本的SNP分型方法,可有效应用于水稻可溶性淀粉合酶基因的种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种等相关研究.     

用等位基因特异PCR检测普通小麦（Triticum aestivum L.）的单核苷酸多态性

 【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3?端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3?端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3?端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg2+、dNTP及Taq DNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3?端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

用等位基因特异POR检测普通小麦（Triticum aestivum L．）的单核苷酸多态性单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3’端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3’端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3’端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg^2＋、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3’端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

大豆蛋白质相关基因SNP的开发和遗传定位

在大豆蛋白质相关基因中利用直接测序法在2个代表性品种Pureukong与Jinpumkong2之间发掘SNP标记,并利用这些标记将蛋白质相关基因定位在遗传图谱上．为了开发SNP分子标记,选择56个蛋白质相关基因并设计相应的引物．结果显示,49个引物获得较好的测序结果．其中,7个引物在2个亲本之间显示多态性,共检测出11个SNP分子标记．2个亲本间SNP的检测频率为1SNP／2400bp．利用杂交获得的重组自交系,大豆蛋白质相关基因被定位到已经构建的以SSR分子标记为主的遗传图谱上．     

水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用研究

Pi35是具有广谱持久抗性的水稻抗稻瘟病基因,在水稻抗病育种中具有重要作用。通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到1个Pi35基因内特异SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物研究结果表明,利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增,可快速判断待测水稻Pi35的基因型。该方法简便快速、成本低廉,可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。     

超甜玉米bt2基因SNP位点的分析及分子标记辅助筛选

【目的】利用等位基因特异PCR技术对超甜玉米的基因型进行分子鉴定,建立根据单核苷酸多态性(SNP)进行分子标记辅助筛选的平台。【方法】根据超甜玉米基因bt2启动子区域序列设计引物,通过等位基因特异PCR扩增,对PCR产物进行测序,利用ClustalX软件,分析比较了32份超甜玉米自交系bt2基因启动子区域的核苷酸序列,并进行了分子鉴定。【结果】在扩增的888bp序列中有3个SNP位点,分别在bt2基因转录起始上游的-20,-103和-107bp处,通过对32份超甜玉米自交系的SNP位点分析,将其区分为AAA和GGG 2种单体型。【结论】利用3个SNP位点中的-103(A/G)位点进行等位基因特异PCR,成功地鉴定了超甜玉米自交系的基因型,建立了通过等位基因特异PCR辅助筛选bt2基因的平台。     

One tube nested-PCR在SNP基因型分型中的应用

nested–PCR是一种在普通PCR基础上发展起来的专门用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。结合nested–PCR技术在水稻中检测SNP的研究,以1个水稻香味基因Fgr和3个稻瘟病基因Pi–ta、Pi9、Pigm为例,把nested–PCR的4条引物同时加在一管PCR反应中进行扩增,在其序列内针对SNP位点设计功能标记,用来扩增含有突变位点的DNA片段。通过优化引物浓度梯度和改良反应程序,达到了一步快速检测SNP基因型的目的。     

One tube nested-PCR在SNP基因型分型中的应用

nested–PCR是一种在普通PCR基础上发展起来的专门用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。结合nested–PCR技术在水稻中检测SNP的研究,以1个水稻香味基因Fgr和3个稻瘟病基因Pi–ta、Pi9、Pigm为例,把nested–PCR的4条引物同时加在一管PCR反应中进行扩增,在其序列内针对SNP位点设计功能标记,用来扩增含有突变位点的DNA片段。通过优化引物浓度梯度和改良反应程序,达到了一步快速检测SNP基因型的目的。     

番茄Cf-5基因的SNP分子标记开发

根据已知的叶霉病抗性基因Cf-5基因序列,设计了3对嵌套引物。以4份抗病材料和4份非抗病材料DNA为模板,扩增番茄Cf-5基因并比较了抗感材料Cf-5基因的序列,在580、2 879 bp位点分别有T与C、G与T的碱基替换,设计了等位基因特异引物,获得了稳定的等位基因PCR产物,成功地开发了抗叶霉病基因Cf-5的SNP标记,为培育抗叶霉病番茄品种奠定了基础。     

基于番茄抗黄化曲叶病毒病基因Ty-5CAPS的SNP标记开发

为了促进SNP技术在番茄抗黄化曲叶病毒病育种中的应用,探讨了将番茄Ty-5 CAPS标记转换成SNP标记进行检测的可行性。首先对Ty-5的CAPS标记Sl NAC1的扩增产物进行测序,设计多对引物,以感病自交系9179和抗病自交系07-025为材料进行PCR,筛选出只在抗病自交系中能扩增出特异条带的SNP引物,将这对引物作为SNP标记;然后,用SNP标记对番茄材料进行分析,验证标记的可行性。结果表明,利用番茄Ty-5 CAPS标记转化的SNP标记,可直接用于番茄抗黄化曲叶病毒病的分子标记辅助选择育种。     

黑麦重复家族成员pAW161(348 bp)的DNA序列分析

黑麦亚端部特异序列pAW161是黑麦350~480 bp重复家族的一个成员。通过pAW161设计的特异引物获得的PCR扩增片段,已成功用于小麦外源转移材料的鉴定。在本研究中,用该引物从供试的分属4个种共7份黑麦材料中都扩增出一条清楚明亮的特异带纹,分别对扩增片段回收、克隆、测序。结果表明,它们的长度都为348bp,该序列简称为pAW161(348 bp)。不同黑麦比较发现,该序列高度保守,同源性达到99.39%,可作为黑麦的亚端部特异序列pAW161的分子标记。该序列存在着6个SNP位点,都位于此序列的3’端的156 bp序列中,而5’端的192 bp的序列无变异;SNP变化在供试材料中不存在物种特异性。从结构上看,pAW161(348 bp)是重复家族pSc200的380 bp基本重复单元的两个头-尾串联重复序列的中间一段。     

PCR方法快速鉴别绞股蓝与乌蔹莓

建立绞股蓝与乌蔹莓2种中药相互鉴别的特异性PCR方法,利用SYBR Green I染料法建立对绞股蓝与乌蔹莓的快速鉴别方法。采集不同产地的绞股蓝与乌蔹莓各9份,通过对其叶绿体DNA中trnL-F片段进行扩增、测序,进行多重序列比对后,根据其变异位点设计相互鉴别的特异性引物,建立特异PCR鉴别方法,并通过加入SYBR Green I染料法建立对2种中药进行快速检测方法,本研究建立了对绞股蓝与乌蔹莓2种中药进行分子鉴别方法,并建立了荧光快速检测方法。     

与棉花无蜜腺基因紧密连锁SSR标记的筛选及SCAR标记的转化

以无蜜腺棉(97014)xTM-1的正、反交后代F1、F2群体为试验材料,采用SSR标记技术,结合集群分类分析法(BSA)进行了棉花无蜜腺性状基因分子标记的筛选.通过对203对SSR引物的筛选,获得1个与蜜腺性状基因紧密连锁的SSR标记BNL1673,连锁距离为1.33 cM.对该标记片段进行序列测定,根据序列特点设计...     

南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究

根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic Nepovirus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR检测引物,对南芥菜花叶病毒和非南芥菜花叶病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应。结果,南芥菜花叶病毒的感病植物组织的PCR产物均出现364bp的特异性扩增条带,而非南芥菜花叶病毒均未出现扩增条带,证明这对引物具有南芥菜花叶病毒鉴定特异性。将提取的南芥菜花叶病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系最低可检出南芥菜花叶病毒提取的RNA模板浓度为150pg/μL。     

基于rbcL序列的半边莲与通泉草的分子鉴别方法

市场流通中半边莲容易与通泉草相互混淆,拟基于rbcL序列建立半边莲与通泉草的分子鉴别方法。采集不同产地的半边莲样品9份,通泉草样品7份,所有受试样品提取总DNA。对其叶绿体DNA中rbcL片段进行扩增、测序,用ClustalX 2.1软件进行多重序列比对后,应用Meg 5.0软件构建NJ系统聚类树进行聚类分析,根据二组样品间的SNP位点设计相互鉴别的特异性引物,建立特异PCR鉴别方法,并应用SYBR Green I染料法建立对2种中草药进行快速检测的方法。本研究建立了对半边莲与通泉草2种中草药进行分子鉴别的方法,并建立了荧光快速检测方法。     

新开发的禾本科通用性分子标记的检测与评估

为开发更多的适用于禾本科Poaceae植物通用性分子标记, 丰富竹类植物的遗传信息, 依据禾本科单拷贝同源基因(COSⅡ)已知序列的保守区域设计了14对引物, 以此引物对刚竹属Phyllostachys植物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增, 并对部分扩增产物进行测序。结果所有引物可以在至少1个材料中得到特异性扩增, 其中7对引物在5个供试材料中均能扩增到产物, 13对引物在5个样本中表现出多态性, 占引物总数的92.9%。对部分扩增产物进行测序, 所测序列均为特异性扩增序列。同一引物在不同样本中的扩增片段间存在单核苷酸多态性(SNP)位点, 部分SNP位点会导致氨基酸序列提前终止或酶切位点变化。对有合适内切酶存在的变异位点进行PCR-RFLP验证, 验证结果与测序结果一致。利用NTsys 2.10e软件, 对5个供试竹种材料进行了亲缘关系分析, 毛竹Phyllostachys edulis与绿粉竹Phyllostachys virdiglaucescens亲缘关系最近, 紫竹Phyllostachys nigra与其他4个竹种亲缘关系最远。所开发的14个COSⅡ引物在刚竹属植物中具一定通用性, 同时挖掘出更多竹类植物中的遗传信息。     

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

一种快速·有效分离T-DNA插入位点的侧翼序列的方法——DW-ACP-PCR技术

DW-ACP-PCR(DNAWalking-Annealing control primer-PCR)是一种分离已知DNA序列的侧翼未知序列的新技术。该技术通过3个嵌套的特异引物分别和ACPC复性控制引物组合,进行3步连续的PCR反应,所有反应可以在1 d内完成。ACP的特殊结构能有效地控制非特异扩增。用DW-ACP-PCR技术扩增7个稻瘟菌T-DNA插入突变体的T-DNA插入位点的侧翼序列,均获得了特异目标片段。     

与黄麻炭疽病抗性相关的SSR分子标记筛选及新型SNP标记开发

为筛选出与黄麻炭疽病抗性相关的新型分子标记,本研究在前期黄麻炭疽病抗性QTL定位结果的基础上,开发出7对可能与黄麻炭疽病抗性基因连锁的新型SNP标记.同时,在前期对重组自交系群体进行田间炭疽病抗性鉴定的基础上,分别以6个抗病株系和6个感病株系的基因组DNA构建了抗池和感池.以抗、感池的DNA为模板,对36对SSR引物和7对SNP引物进行了多态性筛选,从中初步筛选出具有多态性的SSR引物15对,SNP引物2对.继而,分别以12份抗病和感病株系的基因组DNA为模板,对上述具有多态性的SSR和SNP引物进行进一步验证,最终获得1对与黄麻炭疽病抗性相关的SNP标记,其产生的多态性片段大小约为600 bp.     

山羊TGFB3基因的多态性及生物学信息分析

为了解山羊TGFB3基因的多态性,并为优秀山羊品种的选育提供理论依据,选择牛TGFB3基因组序列(NM_001101183)设计1对特异性引物,采用DNA池PCR直接测序法快速检测黔北麻羊、内蒙古白绒山羊和关中奶山羊3个山羊品种的TGFB3基因的多态性.结果表明,只在黔北麻羊TGFB3基因第1外显子212 bp处发现1...